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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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20. Juni 2012

Impfstoff gegen das Epstein-Barr-Virus

R. Ruiss, R. Zeidler, Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Ludwig-Maximilians-Universität München.

Meldungen wie diese finden sich in den Sportteilen der Tageszeitungen mit schöner Regelmäßigkeit: „Der kroatische Tennisprofi Mario Ančić musste monatelang pausieren“. „Der Fußballprofi Olaf Bodden musste 1997 seine aktive Karriere beenden“. Beide fühlen sich außerstande, eine akzeptable körperliche Leistung zu erbringen, sie klagen über ständige Abgeschlagenheit, Schwächeanfälle und körperliche Schmerzen. Der Grund in beiden Fällen: Pfeiffer’sches Drüsenfieber. Der Auslöser: Das Epstein-Barr-Virus. Auch wenn das Pfeiffer’sche Drüsenfieber (auch Infektiöse Mononukleose genannt) nicht, wie bei manchem Leistungssportler, gleich zum Karriere-Aus führen muss, stellt es für fast jeden Erkrankten eine ernstzunehmende und belastende Erkrankung dar. Man schätzt, dass etwa jeder Zweite, der sich im Erwachsenenalter erstmalig mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert, an einem klinisch manifesten Pfeiffer’schen Drüsenfieber erkrankt. In den USA werden jährlich ca. 125.000 Fälle aktenkundig, was einer Inzidenz von 1:2.000 entspricht. Die Häufigkeit dürfte in Deutschland ähnlich hoch sein, exakte Zahlen sind nicht bekannt. In den weniger industrialisierten Ländern dagegen ist die Erkrankung praktisch unbekannt. Wo Großfamilien die übliche Art des Zusammenlebens darstellen, infizieren sich nahezu alle Kinder mit EBV. Bei ihnen verläuft die Infektion in der Regel asymptomatisch.

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Biologie

Die häufigsten Symptome der Infektiösen Mononukleose reichen von Müdigkeit und Unwohlsein über eine Schwellung von Lymphknoten, Tonsillen und Milz bis zu abdominalen Schmerzen. Dennoch verläuft die Erkrankung gewöhnlich harmlos und ist innerhalb von 2-4 Wochen überstanden. Bei 5% der Betroffenen verläuft die Erkrankung allerdings schwerer, wird krankenhauspflichtig und dauert mitunter Monate. Bisweilen wird sie sogar chronisch. Zudem erhöht eine klinisch manifeste Infektiöse Mononukleose den Risikofaktor für die Entwicklung bestimmter B-Zell-Lymphome später im Leben um das 2-3-Fache (1).

EBV ist ein überaus erfolgreiches Virus; etwa 95% der erwachsenen Weltbevölkerung sind damit infiziert. Die Infektion mit EBV erfolgt über die Epithelien des Mundes und des Rachens, von wo aus das Virus auf noch nicht gänzlich geklärte Weise einen Weg in die B-Lymphozyten findet. Eine Woche nach der Infektion sind 5-20% der peripheren Lymphozyten infiziert. Diese Zahl nimmt schnell wieder ab, denn viele der viralen Proteine sind sehr immunogen, und das Immunsystem entwickelt unmittelbar EBV-spezifische Antikörper und T-Zellen, welche die Zahl der infizierten Zellen dauerhaft reduzieren. Eine relativ kleine Zahl infizierter B-Lymphozyten entgeht aber dem Angriff des Immunsystems, so dass EBV in diesem Zellkompartiment für das gesamte Leben seines Wirtes verbleibt. Ob es dauerhaft auch andere Zellen oder Gewebe infizieren kann, ist nach wie vor unklar. Entscheidend scheint aber die „latente“ Lebensform in B-Zellen zu sein, d.h. das Virus bildet keine oder nur sehr wenige Proteine, so dass infizierte B-Zellen vom Immunsystem nicht als solche erkannt und eliminiert werden. Interessanterweise stellt sich ein Gleichgewicht zwischen dem Virus und den infizierten Zellen ein. Deren Zahl ist für jeden Menschen individuell, bleibt dann aber stabil und ändert sich im Laufe der Zeit nur wenig. Wie es dem Virus gelingt, dieses Niveau aufrechtzuhalten, ist nach wie vor unklar.

Die Koexistenz von Virus und Wirt ist normalerweise friedlich – solange das Immunsystem funktioniert und die EBV-infizierten Zellen in Schach hält. Kommt es aber zu einer Immunstörung, kann dies einen Ausfall dieser Überwachung zur Folge haben. Dann tritt eine einmalige biologische Eigenschaft von EBV zutage: Die Fähigkeit, B-Zellen zur ständigen und unkontrollierten Teilung anzuregen.

Pathobiologie

Neben dem Pfeiffer’schen Drüsenfieber spielt EBV bei weiteren Erkrankungen eine wichtige Rolle: Bei der Entstehung verschiedener Krebsarten. Bereits 1964 wurde es als erstes Tumorvirus des Menschen überhaupt identifiziert, damals als Mitverursacher des Burkitt-Lymphoms (2). Mittlerweile kennt man eine ganze Reihe weiterer Erkrankungen, bei denen EBV eine kausale Rolle spielt (Tab. 1). Hierzu zählen verschiedene Krebsarten wie das Nasopharynxkarzinom, das in Südosteuropa gehäuft auftritt, und das Burkitt-Lymphom, das in Äquatorialafrika endemisch ist. Hodgkin-Lymphom und Magenkrebs sind ebenfalls mit EBV assoziiert und kommen insbesondere in den industrialisierten Ländern vor. EBV wird aber auch häufig mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. So gelten die Infektiöse Mononukleose und erhöhte EBV-spezifische Antikörper als Risikofaktoren für die Entwicklung der Multiplen Sklerose (3). Bei weiteren schweren Autoimmunerkrankungen wie dem Systemischen Lupus Erythematodes, der Rheumatischen Arthritis und dem Sjögren-Syndrom leistet EBV wohl einen Beitrag (4).

Auch wenn die Ätiologie dieser Erkrankungen auf molekularer Ebene noch nicht völlig geklärt ist, gilt ein Beitrag von EBV als gesichert. Zu hoch ist der Anteil der Fälle, bei denen sich die virale DNA in den Tumorzellen nachweisen lässt, so dass eine bloße Koinzidenz ausgeschlossen werden kann. Nahezu 100% der Nasopharynxkarzinome und der überwiegende Anteil der endemischen Burkitt-Lymphome sowie jedes zweite Hodgkin-Lymphom sind mit EBV infiziert. Insgesamt wird die Zahl der EBV-assoziierten Krebsfälle auf ca. 200.000 pro Jahr geschätzt (Tab. 2).

Tab. 1: Die bekannten Tumorviren des Menschen.
Tab. 2: Die häufigsten malignen Erkrankungen, bei denen eine Beteiligung von EBV als gesichert gilt. Die Erbsubstanz des Virus wird regelmäßig in weiteren Tumoren wie dem Leiomyosarkom und Sarkomen der Follikulären Dendritischen Zellen gefunden.

 Zweifelsfrei verursacht EBV lebensbedrohliche Lymphome bei immunsupprimierten Patienten, insbesondere Personen mit AIDS oder Transplantationspatienten: 80% aller AIDS-Lymphome sind EBV-positiv.

Diese Eigenschaft macht EBV besonders für primär oder sekundär immundefiziente Patienten zu einem lebensbedrohlichen Risiko. Diese Risikogruppe könnte entsprechend stark von einem wirksamen Impfstoff profitieren.

Impfstoffe und Entwicklung

Nicht nur die Vielzahl der durch EBV verursachten Erkrankungen unterstreicht den Sinn und die Notwendigkeit eines Impfstoffs. Epidemiologische Daten zeigen auch, dass allein die Vermeidung oder Linderung der Infektiösen Mononukleose substantiell zur wirtschaftlichen Entlastung des Gesundheitswesens beitragen würde. So wurden in den vergangenen 25 Jahren verschiedene Ansätze zur Entwicklung eines zuverlässigen und sicheren Impfstoffes gegen EBV verfolgt – bisher ohne durchschlagenden Erfolg. Dementsprechend hat bislang keine Vakzine eine Marktzulassung erhalten. EBV macht es den Impfstoffentwicklern auch nicht einfach: Die Biologie des Virus stellt ganz besondere Herausforderungen an Forscher, denn bislang existiert keine Möglichkeit, einen EBV-Lebendimpfstoff auf konventionelle Weise herzustellen, wie dies etwa bei einem anderen Herpesvirus, dem Windpockenvirus Varizella zoster, möglich ist.

Auf der Suche nach Alternativen wurden die ersten Impfversuche mit rekombinanten Vaccinia-Viren, welche die Erbinformation für gp350, einem wichtigen Membranprotein von EBV trugen, durchgeführt. Diese Viren führten in immunisierten Seidenäffchen zur Bildung neutralisierender Antikörper, welche die Tiere teilweise vor einer Infektion mit EBV schützten (6). Für einen weiteren Versuch wurde das gp350-Gen in replikationsdefiziente Adenoviren eingebaut. Die dadurch gebildeten gp350-spezifischen Antikörper stellten sich zwar in der Zellkultur als nicht-neutralisierend heraus, schützten die geimpften Affen aber dennoch vor EBV-assoziierten Lymphomen (7).

1995 wurden in China die ersten klinischen Versuche zur Evaluierung einer gp350-exprimierenden Vakzine an EBV-seronegativen Personen durchgeführt. Obwohl bei allen Geimpften eine Serokonversion nachgewiesen werden konnte, zeigte es sich, dass die gebildeten Antikörper keinen ausreichenden Schutz gegen EBV darstellten (8). Diese Versuche wurden daher nicht weiterverfolgt. Derzeit befindet sich ein gp350-Peptidimpfstoff in Kombination mit dem Adjuvans AS04 in der klinischen Prüfung. Immunisierte Versuchspersonen wiesen über den Versuchszeitraum von 18 Monaten hinweg hohe gp350-Antikörpertiter auf, und auch das Auftreten von Infektiöser Mononukleose wurde deutlich reduziert (9).

Alternative Strategien für eine EBV-Vakzine basieren auf der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen (10, 11). Anstatt die Primärinfektion zu verhindern, soll dabei den klinischen Symptomen vorgebeugt werden. Solche Versuche wurden beispielsweise mit Peptiden des EBV-Proteins EBNA3a durchgeführt (11). Neben Peptidimpfstoffen werden derzeit weitere, auf viralen Vektoren basierende Vakzine erprobt. Ermutigende Resultate konnten dabei mit einem tetrameren Vaccinia-Virus erreicht werden. Die kombinierte Expression zweier latenter (EBNA2 und EBNA3C) und zweier lytischer (gp110 und gp350) EBV-Proteine führte in immunisierten Mäusen zur Bildung von Antikörpern und T-Zellen gegen jedes der vier Proteine (12). Ein weiteres rekombinantes Vaccinia-Impfvirus mit den beiden latenten EBV-Proteinen EBNA1 und LMP2 steht kurz vor einer klinischen Phase-II-Studie. Nachdem es seine Immunogenität und gute Verträglichkeit unter Beweis gestellt hat, soll nun untersucht werden, ob es bei Patienten mit Nasopharynxkarzinom die Anzahl an Krebszellen reduziert (13).

Die Bedeutung von T-Zellen für die Kontrolle EBV-assoziierter Erkrankungen wird an PTLD (Post-Transplant Lymphoproliferative Disorder)-Patienten deutlich. Nach dem adoptiven Transfer EBV-spezifischer zytotoxischer T-Zellen kommt es häufig zu einem schnellen und kompletten Rückgang der Lymphome und zum Aufbau eines schützenden Immungedächtnisses (14, 15). Es ist daher zweifelhaft, und Tierversuche bestärken diesen Zweifel (16), dass gp350-Impfstoffe, die v.a. auf eine effektive Induktion neutralisierender Antikörper setzen, den Menschen wirkungsvoll vor EBV-assoziierten Tumorerkrankungen schützen können.

Herpesviren sind große, komplexe Viren, deren Bekämpfung das gesamte Immunsystem fordert. Der Traum jedes EBV-Impfstoffforschers ist eine Vakzine, die sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induziert und so wirksam vor allen EBV-assoziierten Erkrankungen schützt. Ob sich dieser Traum in Zukunft realisieren lässt, ist schwer abzusehen. Einen großen Schritt in diese Richtung könnten virus-like particles (VLPs) darstellen. Im Gegensatz zu attenuierten Lebendviren, wie sie beispielsweise zur Impfung gegen Masern und Röteln eingesetzt werden, enthalten diese VLPs keine virale DNA, sind daher nicht infektiös. Strukturell und immunologisch ähneln sie infektiösem EBV. Da sie keine virale DNA enthalten und sich somit nicht vermehren können, sind VLPs deutlich sicherer als abgeschwächte Lebendviren und können auch bei immunsupprimierten Patienten verwendet werden. VLPs werden seit vielen Jahren erfolgreich als Impfstoff gegen das Hepatitis-B-Virus eingesetzt. Als Impfstoff gegen bestimmte Stämme der humanen Papillomviren sollen sie außerdem seit einigen Jahren junge Frauen vor der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs schützen.

Auch im Falle von EBV haben sich in unseren Versuchen VLPs als äußerst vielversprechend erwiesen. Die Partikel werden von einer Zelllinie generiert, die ein verändertes EBV-Helfergenom trägt. Alle potentiell onkogenen viralen Proteine – EBV ist ein Tumorvirus – wurden entfernt oder funktionell inaktiviert und das Genom so verändert, dass es nicht in Viruspartikel eingebaut werden kann. Diese Zelllinie produziert daher DNA-freie EBV-like particles, die sämtliche viralen Strukturproteine in ihrer natürlichen Konformation enthalten – ein wichtiger Vorteil gegenüber weniger komplexen Impfstoffen wie Peptiden. Auch biologisch ähneln diese VLPs dem Wildtyp-Virus: Sie besitzen einen B-Zell-Tropismus und werden, nach Interaktion mit dem zellulären Rezeptor CD21, von diesen Zellen internalisiert. Im Zellinneren werden sie dann degradiert und die entstehenden Peptide dem Immunsystem präsentiert. Auf diese Weise aktivieren EBV-VLPs in vitro CD8+-zytotoxische T-Killerzellen und CD4+-T-Helferzellen. Auch in einem Mausmodell führte die Immunisierung mit VLPs zur Ausbildung einer starken zel-lulären sowie humoralen Immunantwort (17). Die produzierten Antikörper erwiesen sich zudem als neutralisierend, d.h. sie verhinderten die Infektion von B-Zellen durch EBV. Die virusspezifischen Immunantworten waren dabei nicht auf Proteine der Membran und des Kapsids beschränkt, sondern umfassten auch Proteine, die für die Virusvermehrung essentiell sind. VLPs könnten auch einen Schutz gegen EBV-assoziierte Tumoren induzieren, da T-Zellen und Antikörper auch gegen die dort zu findenden latent membrane proteins (LMP)-1 und -2 gebildet wurden. Inwieweit diese Vakzine tatsächlich vor EBV-assoziierten Erkrankungen schützt, wollen wir präklinisch und in absehbarer Zeit auch in EBV-seronegativen Transplantationspatienten testen.

Diese sind besonders gefährdet, an EBV-assoziierten Transplantationslymphomen (PTLD) zu erkranken. Da sie noch keinen Kontakt mit EBV hatten, besitzen sie zum Zeitpunkt der Transplantation kein schützendes immunologisches Gedächtnis. Infizieren sie sich dann in immunsupprimiertem Zustand auf natürlichem Wege oder über das transplantierte Organ mit EBV, können sie keinen Immunschutz aufbauen, so dass sich EBV-infizierte B-Zellen weitgehend ungestört vermehren können. Das PTLD-Risiko hängt von der Art des transplantierten Organs ab, ist aber insgesamt etwa 20 Mal höher als das von EBV-positiven Transplantatempfängern. Und Kinder trifft es besonders häufig: 10 und mehr Prozent aller transplantierten EBV-seronegativen Kinder entwickeln im Laufe des ersten Jahres nach Transplantation ein PTLD, viele der Patienten versterben daran. Wiederholte Immunisierungen mit dem VLP-Vakzin vor und auch nach der Transplantation zum Aufbau und zur Stimulation einer wirksamen EBV-Immunität könnten dieses Risiko deutlich reduzieren.

 

 

 

 

Prof. Dr. med. Reinhard Zeidler

Klinik und Poliklinik für
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
Ludwig-Maximilians-Universität
Marchioninistr. 15
81377 München

E-Mail: Reinhard.Zeidler@med.lmu.de

 

 

 

Dr. med. Romana Ruiss

Klinik und Poliklinik für
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
Ludwig-Maximilians-Universität
Marchioninistr. 15
81377 München

E-Mail: romana.ruiss@helmholtz-muenchen.de

 

Abstract

R. Ruiss, R. Zeidler, Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Ludwig-Maximilians-Universität München.

Epstein-Barr Virus (EBV) is an ubiquitous human herpes virus which can lead to infectious mononucleosis and which is also causally associated with different types of malignancies including Hodgkin’s disease, gastric cancer and nasopharyngeal cancer. EBV is a major cause for morbidity and mortality in immunocompromised individuals. Above all, transplant patients who had no contact with the virus prior to immunosuppression frequently develop EBV-associated malignancies, but a prophylactic EBV vaccination might lower this risk significantly. Virus-like particles (VLPs) mimic the structure of the parental virus, but lack the viral genome and are therefore considered safe and efficient vaccine candidates. We engineered EBV-derived VLPs which are highly immunogenic and elicit humoral and strong cellular immune responses in vitro and in a preclinical model in vivo. Our findings suggest that VLPs might be attractive candidates for a safe and effective EBV vaccine.

Keywords: EBV, immunosuppression, malignancies

 

Literaturhinweise:
(1) Becker N, Fortuny J, Alvaro T, et al. (2009) Medical history and risk of lymphoma: results of a European case-control study (EPILYMPH). J Cancer Res Clin Oncol 135:1099-1107.
(2) Epstein MA, Achong BG, Barr YM (1964) Virus Particles In Cultured Lymphoblasts From Burkitt‘s Lymphoma. Lancet 1:702-703.
(3) Lucas RM, Hughes AM, Lay ML, et al. (2011) Epstein-Barr virus and multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 82:1142-1148.
(4) Toussirot E, Roudier J (2008) Epstein-Barr virus in autoimmune diseases. Best Pract Res Clin Rheumatol 22:883-896.
(5) Cohen JI, Fauci AS, Varmus H, et al. (2011) Epstein-barr virus: an important vaccine target for cancer prevention. Sci Transl Med 3:107fs7.
(6) Mackett M, Cox C, Pepper SD, et al. (1996) Immunisation of common marmosets with vaccinia virus expressing Epstein-Barr virus (EBV) gp340 and challenge with EBV. J Med Virol 50:263-271.
(7) Ragot T, Finerty S, Watkins PE, et al. (1993) Replication-defective recombinant adenovirus expressing the Epstein-Barr virus (EBV) envelope glycoprotein gp340/220 induces protective immunity against EBV-induced lymphomas in the cotton-top tamarin. J Gen Virol 74:501-507.
(8) Gu SY, Huang TM, Ruan L, et al. (1995) First EBV vaccine trial in humans using recombinant vaccinia virus expressing the major membrane antigen. Dev Biol Stand 84:171-177.
(9) Sokal EM, Hoppenbrouwers K, Vandermeulen C, et al. (2007) Recombinant gp350 vaccine for infectious mononucleosis: a phase 2, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate the safety, immunogenicity, and efficacy of an Epstein-Barr virus vaccine in healthy young adults. J Infect Dis 196: 1749-1753.
(10) Rickinson AB, Moss DJ (1997) Human cytotoxic T lymphocyte responses to Epstein-Barr virus infection. Annu Rev Immunol 15:405-431.
(11) Moss DJ, Schmidt C, Elliott S, et al. (1996) Strategies involved in developing an effective vaccine for EBV-associated diseases. Adv Cancer Res 69:213-245.
(12) Lockey TD, Zhan X, Surman S, et al. (2008) Epstein-Barr virus vaccine development: a lytic and latent protein cocktail. Front Biosci 13:5916-5927.
(13) Taylor GS, Haigh TA, Gudgeon NH, et al. (2004) Dual stimulation of Epstein-Barr Virus (EBV)-specific CD4+- and CD8+-T-cell responses by a chimeric antigen construct: potential therapeutic vaccine for EBV-positive nasopharyngeal carcinoma. J Virol 78:768-778.
(14) Moosmann A, Bigalke I, Tischer J, et al. (2010) Effective and longterm control of EBV PTLD after transfer of peptide-selected T cells. Blood 115:2960-2970.
(15) Rooney CM, Smith CA, Ng CY, et al. (1995) Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet 345:9-13.
(16) Epstein MA, Randle BJ, Finerty S, et al. (1986) Not all potently neutralizing, vaccine-induced antibodies to Epstein-Barr virus ensure protection of susceptible experimental animals. Clin Exp Immunol 63:485-490.
(17) Ruiss R, Jochum S, Wanner G, et al. (2011) A virus-like particle-based epstein-barr virus vaccine. J Virol 85:13105-13113.

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