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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel

05. Januar 2003 Neuropathologie der Gliome und therapierelevante molekularbiologische Untersuchungen

Dr. med. Wolf Müller, Dr. med. Christian Hartmann und Prof. Dr. med. Andreas von Deimling; Institut für Neuropathologie, Charité, Berlin

Seit Jahrzehnten wird versucht, entscheidende genetische und chromosomale Veränderungen in der Genese von Gehirntumoren aufzuspüren, um diese für diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke nutzen zu können. Während sich im therapeutischen Vorgehen und in der Prognose von Patienten mit Glioblastomen trotz intensiver wissenschaftlicher Bemühungen in den letzten Jahren nichts Wesentliches verändert hat, sind die neueren Erkenntnisse auf dem Gebiet der Oligodendrogliome vielversprechend und in vielem wegweisend für zukünftige Betätigungsfelder der Pathologie und Neuropathologie. Daher soll genauer auf diese Tumoren eingegangen werden.
Die Klassifikation und Gradierung der primären Gehirntumoren erfolgt heute nach den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Diese Richtlinien berücksichtigen in erster Linie morphologische Besonderheiten der einzelnen Tumorentitäten. Die Diagnose eines Tumors stützt sich vor allem auf das Erscheinungsbild des vom Untersucher zu beurteilenden histologischen Präparates.
Erschwert wird die Diagnosestellung im Einzelfall durch das Fehlen charakteristischer morphologischer Merkmale in der entnommenen Tumorprobe (z.B. durch nicht repräsentative Probenentnahme aus Randbereichen eines pathologischen Prozesses) oder durch operationsbedingte artifizielle Veränderungen am Tumorgewebe (z.B. durch den Einsatz koagulierender Instrumente zur Blutstillung während der Probenentnahme). Hinzu kommen interindividuelle Unterschiede in der Gewichtung morphologischer Charakteristika durch den Untersucher selbst.
Eine möglichst einheitliche, zuverlässige und vom Untersucher weitgehend unabhängige Diagnosesicherung ist wünschenswert. Nicht nur Therapieentscheidungen und die prognostische Einschätzung eines Tumors hängen von ihr ab, auch wissenschaftliche Untersuchungen benötigen eine möglichst eindeutige Diagnose.
Ein bereits etabliertes diagnostisches Hilfsmittel in der Neuropathologie ist die immunhistochemische Untersuchung. Manche Tumoren haben ein charakteristisches Proteinexpressionsprofil. Durch Antikörper vermittelten Nachweis dieser Proteine kann eine Diagnose zusätzlich untermauert und gestützt werden.
Neuere therapierelevante molekularbiologische Untersuchungen an Oligodendrogliomen sind Gegenstand nachfolgender Ausführungen. 0

Histologie der Oligodendrogliome und diagnostische Probleme
Die Inzidenz von Oligodendrogliomen wird in älteren Publikationen mit 3-5% der primären Gehirntumoren angegeben. Neueren Erkenntnissen zufolge liegt sie möglicherweise deutlich höher. Einer der Gründe, warum die Inzidenz nicht genau bestimmbar scheint, liegt in der diagnostischen Herausforderung, vor die der Untersucher im Falle der Oligodendrogliome gestellt wird.
Typische histologische Merkmale, wie die „Honigwaben“- oder „Spiegelei“-Morphologie der Tumorzellen sind nicht in allen Oligodendrogliomen nachweisbar (Abb. 1a). Auch fokale kleinspritzige Verkalkungen, sind zwar typisch, aber keineswegs immer anzutreffen (Abb. 1b). 1
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass anaplastische Varianten der Oligodendrogliome alle morphologischen Kriterien eines Glioblastoms erkennen lassen können. Sie zeichnen sich dann durch eine hohe Zelldichte aus (Abb. 2a). Die erhöhte Zellpleomorphie dieser Tumoren kann das oligodendrogliale Erscheinungsbild der Tumorzellen verschleiern (Abb. 2b).
Die Gefäße können mikrovaskuläre/endotheliale Proliferate aufweisen (Abb. 2c) und es können kleinflächige z.T. strichförmige Nekrosen auftreten (Abb. 2d).
Die Abgrenzung anaplastischer Oligodendrogliome von Glioblastomen kann im Einzelfall mit histomorphologischen Untersuchungen allein nicht möglich sein, so dass erst der weitere klinische Verlauf Aufschluss über die tatsächliche Diagnose gibt.
Neben den Oligodendrogliomen muss an dieser Stelle eine weitere Tumorentität eingeführt werden. Es handelt sich hierbei um die Oligoastrozytome oder Mischgliome. Diese besitzen sowohl astrozytäre als auch oligodendrogliale Anteile. Von einem Teil dieser Tumoren ist bekannt, dass sie ein ähnliches klinisches Verhalten und ähnliche biologische Veränderungen aufweisen wie Oligodendrogliome. Möglicherweise stammen Oligodendrogliome und Oligoastrozytome von den gleichen Vorläuferzellen ab.
Die diagnostischen Kriterien sind für die Oligoastrozytome weniger scharf definiert und lassen Raum für Untersucher-abhängige Interpretationsunterschiede. Ein Grund hierfür ist, dass die vom Untersucher im Schnittpräparat gesehenen oligodendroglialen oder astrozytären Anteile eines Tumors nicht repräsentativ für die Verteilung im Gesamttumor sein müssen.
Zur Qualitätssicherung der Diagnose dieser Tumoren sind verlässliche Zusatzuntersuchungen wünschenswert, um eine adäquate Therapieplanung durchführen zu können.

Molekularbiologische Untersuchungen an Oligodendrogliomen
In den letzten Jahren finden zunehmend molekularbiologische Methoden in der Therapieplanung von Oligodendrogliomen Anwendung. Ausgangspunkt dieser Entwicklung ist die Arbeit von Cairncross et al. aus dem Jahre 1998 (1).
Kernaussage dieser klinischen Studie war, dass Patienten, deren anaplastischen Oligodendrogliome Verluste chromosomaler Abschnitte (Allelverluste) auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 (1p) und dem langen Arm von Chromosom 19 (19q) aufwiesen von einer chemotherapeutischen Behandlung (PCV) stärker profitierten, länger rezidivfrei blieben und sich durch eine längere Gesamtüberlebenszeit auszeichneten. Die Erkenntnisse dieser Arbeit scheinen sich in nachfolgenden Studien zu bestätigen (3).
Seit 1998 führen wir routinemäßig Untersuchungen zum Nachweis von Verlusten chromosomaler Abschnitte auf 1p und 19q bei allen Patienten mit Oligodendrogliomen durch, um diese im klinischen Entscheidungsprozeß der Therapieplanung nutzbar zu machen und um eigene Erkenntnisse über die molekularen Veränderungen dieser Tumoren und ihrem klinischen Verhalten zu gewinnen. 2

Nachweis von Verlusten chromosomaler Abschnitte auf 1p und 19q
Die Analyse nutzt populationsspezifische Polymorphismen. Bei diesen Polymorphismen handelt es sich um Normvarianten nicht kodierender chromosomaler Abschnitte. Das heißt, sie liegen zwischen den Abschnitten auf den chromosomalen Armen von Chromosom 1 und 19, die Gene kodieren.
Für die PCR (Polymerasekettenreaktion)-gestützte Analyse werden sowohl genomische DNS aus dem Tumorgewebe als auch Lymphozyten-DNS aus dem peripheren Blut des Patienten benötigt. Tumor-DNS kann aus Frischgewebe aber auch aus im Paraffin eingebettetem Gewebe gewonnen werden, was die Aufarbeitung archivierter Tumorproben auch retrospektiv ermöglicht. Die Leukozyten-DNS dient zur Erkennung heterozygoter Merkmalsträger.
In einem ersten Schritt werden die zu untersuchenden chromosomalen Abschnitte in einer PCR-Reaktion amplifiziert. Die Fragmente haben eine durchschnittliche Länge von 100-200 bp. Wichtig für das Verständnis der Methode ist, dass es sich bei den Polymorphismen um sogenannte Längenpolymorphismen handelt. Die Normvariante besteht also nicht in einer Sequenzvariante mit Austausch einzelner Basen, sondern in einer unterschiedlichen Anzahl repetitiver, d.h. wiederholter Basensequenzen.
Ein homozygoter Träger eines Merkmals besitzt zwei Allele gleicher Fragmentlänge. In einer elektrophoretischen Auftrennung nach Fragmentgröße überlagern sich beide Allele und eine Aussage über Verlust chromosomaler Ab-schnitte in diesem Bereich des Chromosoms ist nicht möglich (nicht informativer Marker; Abb. 3a). Ist der Untersuchte heterozygot, weisen die beiden Allele eine unterschiedliche Länge auf. Diese werden dann in der Elektrophorese als Einzelbanden sichtbar (informativer Marker, Abb. 3b).
Werden nun Leukozyten-DNS-, Tumor-DNS-Paare eines Patienten untersucht, so sind im Falle der heterozygoten, informativen Marker zwei Befunde möglich. Es können beide Allele sowohl in der Leukozyten-DNS als auch in der DNS des Tumors nachgewiesen werden (Abb. 3b). In diesem Falle wäre die Heterozygotie für das untersuchte Merkmal im Tumorgewebe erhalten geblieben (Normalbefund).
Die zweite Möglichkeit ist der Nachweis von Verlust eines der beiden Allele im Tumorgewebe (Abb. 3c). Dann hätte das Tumorgewebe die Heterozygotie für das untersuchte Merkmal verloren - man spricht dann von "loss of heterozygosity" (LOH).
Die von uns verwendeten Marker auf 1p und 19q sind so gewählt, dass sie den Abschnitt des Chromosoms abdecken, der in den meisten der oligodendroglialen Tumoren verloren geht. Für 1p ist das die Region 1p36 und für Chromosom 19q die Region 19q13.3. Ein weiteres Auswahlkriterium ist die Heterozygotenhäufigkeit in der kaukasischen, entspricht der lokalen, Bevölkerung. Da homozygote Merkmalsträger auftreten können, werden jeweils fünf Marker auf den beiden chromosomalen Abschnitten untersucht.

FISH als Alternativmethode
Im klinischen Alltag von Vorteil wäre eine Untersuchungsmethode, die nicht nur an archiviertem Paraffin eingebettetem Material durchgeführt werden kann, sondern die auch ohne Referenz Leukozyten-DNS des betreffenden Patienten auskommt. Die Fluoreszenz vermittelte in situ Hybridisierung (FISH) ist eine solche Methode (2).
Vereinfacht dargestellt werden Fluoreszenz-markierte chromosomale Ab- schnitte mit Schnittpräparaten der Tumoren inkubiert. Sind die entsprechenden chromosomalen Sequenzen im Kern der Tumorzellen vorhanden, dann lagern sich die Fluoreszenz-markierten Sonden an; sie „hybridisieren“ mit den ihnen komplementären Strukturen. Sind beide Allele vorhanden, dann erhält man zwei kernständige Fluoreszenzsignale. Im Falle eines Verlustes einer Allelkopie ist nur ein Signal nachweisbar. Der Patient muss für das untersuchte Merkmal nicht heterozygot sein, um einen eindeutigen Befund zu erhalten, da FISH absolute Kopien eines Allels darstellt.
Nachteile dieser Methode sind aber, dass sie mit einem erheblichen technischen Aufwand verbunden ist und auf jeden Tumor individuell eingestellt werden muss, um verlässliche Daten zu erhalten. Auch ist die Auswertung der Befunde nur mit einem kostspieligen technischen Aufwand zu bewerkstelligen, so dass diese Methode bis auf wenige spezialisierte Zentren in der nächsten Zeit keinen Eingang in die Routineuntersuchungen finden wird.
Neben technischen Problemen gibt es aber auch methodische Einschränkungen. In der Genese von Tumoren kommt es in einem Teil der Tumoren zum Verlust eines der beiden Allele bei gleichzeitiger Verdopplung des verbleibenden Allels auf dem anderen Chromosom. In diesem Falle ist die Heterozygotie für dieses Merkmal im Tumorgewebe verloren gegangen.
Während die klassische PCR-vermittelte LOH-Analyse den Verlust des einen Allels aufdecken würde, erhält man in diesem Fall in der FISH Untersuchung zwei Signale, da FISH nicht den Verlust der Heterozygotie anzeigt, sondern nur die Anzahl der vorhandenen Genkopien im untersuchten chromosomalen Abschnitt. Daher sollte FISH mit der klassischen PCR-gestützten LOH Untersuchung kombiniert werden.

Neue Erkenntnisse und neue Implikationen
Anhand der systematischen LOH-Untersuchungen von 1p und 19q bei Patienten mit Oligodendrogliomen lässt sich verdeutlichen, wie eng klinische Daten und molekularbiologische Erkenntnisse miteinander verbunden sein können.
Die Analyse großer Serien von Oligodendrogliomen und Oligoastrozytomen ließ eine regionale Heterogenität dieser Tumoren erkennen. Temporal wachsende Oligodendrogliome und Oligoastrozytome wiesen signifikant weniger häufig Verluste chromosomaler Abschnitte auf 1p und 19q auf als entsprechende Tumoren in anderen Hirnregionen (6,7). Im Gegenzug fanden sich temporal mehr Mutationen im Tumorsuppressorgen TP53.
Aus klinischen Untersuchungen ist bekannt, dass temporale Oligodendrogliome und Oligoastrozytome prognostisch ungünstiger einzustufen sind. Die molekularen Befunde lassen vermuten, dass dies Ausdruck unterschiedlicher biologischer Prozesse in diesen Tumoren sein könnte.
Auch für das Verständnis der Genese und vor allem der Herkunft der Oligodendrogliome sind diese Einblicke von Bedeutung. Sie zeigen, dass Tumoren mit ähnlichen morphologischen Charakteristika unterschiedliche biologische Eigenschaften aufweisen können, und sie lassen die Vermutung zu, dass diese Tumoren auf verschiedene Vorläuferzellen zurückzuführen sind.

Ausblicke: LOH 1p und 19q in Glioblastomen
Bislang galten frühes Erkrankungsalter und ein hoher Karnofsky Index zum Zeitpunkt der Diagnose als prognostisch günstige Merkmale bei Patienten mit Glioblastomen.
In neueren Untersuchungen zu potentiell prognostisch relevanten molekularen und klinischen Parametern an großen Gruppen unselektierter Glioblastome scheinen sich chromosomale Verluste auf 1p und 19q als zusätzliche prognostisch günstige Merkmale auch für Glioblastome zu erweisen. Dies gilt in erster Linie für den kombinierten Allelverlust auf 1p und 19q (4,5). Hervorzuheben ist an dieser Stelle, dass auch die erneute Re-evaluation der entsprechenden Tumoren keinen Nachweis oligodendroglialer Anteile erkennen ließ.
Regelhaft auftretende Allelverluste in Tumoren wurden in der Vergangenheit zur Identifikation neuer Tumorsuppressorgene genutzt. Nach der Theorie von Knudson bedarf es zweier unabhängiger Ereignisse auf molekularer Ebene, um ein Gen funktionsuntüchtig zu machen.
Als initiales Ereignis tritt eine somatische Mutation in einer der beiden Genkopien auf. Dies führt zu einer Funktionseinschränkung oder eines Funktionsverlustes des veränderten Allels bei intakter Funktion der anderen Genkopie. Zu einem späteren Zeitpunkt geht die Funktion auch des zweiten Allels verloren. Dies kann durch unterschiedliche Mechanismen erfolgen. Eine Möglichkeit ist der Verlust des chromosomalen Abschnitts, auf dem das Gen lokalisiert ist (Allelverlust).
In den letzten Jahren wurde versucht, die Tumorsuppressorgene auf 1p und 19q zu identifizieren. Zahlreiche Gene wurden bisher ohne Erfolg auf somatische Mutationen untersucht.
Eine weitere Möglichkeit der funktionellen Ausschaltung eines Gens stellt die Methylierung ihrer Promotoren dar. Diese epigenetischen Phänomene, die die Gensequenz unberührt lassen und somit einer Mutationsanalyse nicht zugänglich sind, treten immer mehr in das Zentrum der Untersuchungen.
Eine weitere Möglichkeit, sich der Identifikation tumorrelevanter Gene zu nähern stellt in neuester Zeit die Microarray-Analyse dar. Diese kann unter Umständen Tumortyp spezifische Expressionsprofile aufzeigen. Es ist denkbar, dass im Falle eines differentiellen Expressionsprofils einzelner Tumorentitäten die Diagnose anhand molekularbiologischer Befunde gesichert werden kann.
Die Diagnose und Gradierung der Gehirntumoren wird auch weiterhin überwiegend anhand morphologischer und immunhistochemischer Befunde erfolgen. Für individuelle, dem Tumor angepasste, Therapieplanungen und eine Erweiterung individueller Prognoseaussagen werden molekularbiologische Untersuchungen zunehmend an Bedeutung gewinnen. 3

Quelle: Referenzen:

(1) Specific genetic predictors of chemotherapeutic response and survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas. Cairncross JG, Ueki K, Zlatescu MC, Lisle DK, Finkelstein DM, Hammond RR, Silver JS, Stark PC, Macdonald DR, Ino Y, Ramsay DA, Louis DN. J Natl Cancer Inst 1998 Oct 7;90(19):1473-9

(2) Localization of common deletion regions on 1p and 19q in human gliomas and their association with histological subtype. Smith JS, Alderete B, Minn Y, Borell TJ, Perry A, Mohapatra G, Hosek SM, Kimmel D, O'Fallon J, Yates A, Feuerstein BG, Burger PC, Scheithauer BW, Jenkins RB. Oncogene 1999 Jul 15;18(28):4144-52

(3) Alterations of chromosome arms 1p and 19q as predictors of survival in oligodendrogliomas, astrocytomas, and mixed oligoastrocytomas. Smith JS, Perry A, Borell TJ, Lee HK, O'Fallon J, Hosek SM, Kimmel D, Yates A, Burger PC, Scheithauer BW, Jenkins RB. J Clin Oncol 2000 Feb;18(3):636-45

(4) Long survival and therapeutic responses in patients with histologically disparate high-grade gliomas demonstrating chromosome 1p loss. Ino Y, Zlatescu MC, Sasaki H, Macdonald DR, Stemmer-Rachamimov AO, Jhung S, Ramsay DA, von Deimling A, Louis DN, Cairncross JG. J Neurosurg 2000 Jun;92(6):983-90

(5) Impact of genotype and morphology on the prognosis of glioblastoma. Schmidt MC, Antweiler S, Urban N, Mueller W, Kuklik A, Meyer-Puttlitz B, Wiestler OD, Louis DN, Fimmers R, von Deimling A. J Neuropathol Exp Neurol 2002 Apr;61(4):321-8

(6) Tumor location and growth pattern correlate with genetic signature in oligodendroglial neoplasms. Zlatescu MC, TehraniYazdi A, Sasaki H, Megyesi JF, Betensky RA, Louis DN, Cairncross JG. Cancer Res 2001 Sep 15;61(18):6713-5

(7) Genetic signature of oligoastrocytomas correlates with tumor location and denotes distinct molecular subsets. Mueller W, Hartmann C, Hoffmann A, Lanksch W, Kiwit J, Tonn J, Veelken J, Schramm J, Weller M, Wiestler OD, Louis DN, von Deimling A. Am J Pathol 2002 Jul;161(1):313-9


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