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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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28. August 2012

Neue Biomarker

Zirkulierende Tumorzellen in Krebspatienten

T. M. Gorges, S. Riethdorf, K. Pantel, Institut für Tumorbiologie, Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf.

Aufgrund der hohen Sterberate durch Metastasen wird eindringlich nach Biomarkern gesucht, die zum Nachweis der frühen Tumorzellstreuung und für eine zeitnahe Kontrolle der Effizienz systemischer Therapien gegen metastasierte Zellen eingesetzt werden können. Bildgebende Verfahren scheinen für dieses Vorhaben allein nicht auszureichen. Die molekularbiologische Analyse von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) kann dazu genutzt werden, um diagnostische, pharmakodynamische und prognostische Informationen in Bezug auf die Erkrankung zu erhalten, wobei CTCs aktuell auch als prädiktive Marker diskutiert werden. Obwohl in den letzten Jahren diverse Ansätze zum CTC-Nachweis entwickelt wurden, hat bisher lediglich eine Methode (CellSearchTM-System) von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) die Zulassung zum Nachweis von CTCs aus Blutproben von Patienten erhalten. Trotz prognostischer Relevanz der CTCs bleibt ihr Einsatz für Therapieentscheidungen durch klinische Studien zu klären.

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Krebs ist nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen die häufigste Todesursache in den westlichen Industrienationen, wobei epidemiologische Daten darauf hindeuten, dass Krebserkrankungen in naher Zukunft kardiovaskuläre Leiden als häufigste Todesursache sogar ablösen werden. Allein in Deutschland werden jedes Jahr über 400.000 Neuerkrankungen an Krebs registriert und etwa 200.000 krebsbedingte Todesfälle dokumentiert (1). Bösartige (maligne) Tumoren epithelialer Gewebe (Karzinome) stellen die Mehrzahl aller Krebserkrankungen dar und verursachen einen Großteil der krebsbedingten Todesfälle.

Für nahezu jede Tumorerkrankung gilt, dass Frühstadien mit größerem Erfolg behandelt werden können als fortgeschrittene Tumorstadien. Ausgehend von dieser Erkenntnis werden in der klinischen Situation verschiedene Strategien zum frühzeitigen Nachweis einer Metastasierung angewendet, wobei in der Regel bildgebende Untersuchungsmethoden wie Computertomographie (CT), Röntgen, Ultraschall, Magnetresonanztomographie (MRT) oder Positronenemissionstomographie (PET) zum Einsatz gelangen. Obwohl die Sensitivität bildgebender Techniken in den letzten Jahren gesteigert werden konnte, scheinen diese Verfahren für die spezifische Erkennung der frühen Tumorzellstreuung jedoch ungeeignet, wodurch eine Erkrankung oftmals erst in einem späten Stadium evident gemacht werden kann. Überdies lässt sich mit diesen Technologien in der adjuvanten (postoperativen) Situation ein zeitnahes Ansprechen der Therapie nicht eindeutig darstellen, da diese Methoden die Entstehung von Rezidiven ebenfalls erst nach Monaten oder Jahren aufzeigen können.

Die molekulare Analyse von zirkulierenden Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) bietet einen viel versprechenden neuen Ansatz im onkologischen Forschungsbereich. CTCs sind Krebszellen, die sich vom Primärtumor gelöst haben und systemisch über das Blutsystem streuen können (2). Tumorzellen, die sich vom Primärtumor abgesondert haben, besiedeln im frühen Stadium der Metastasierung als erstes häufig die regionären Lymphknoten oder das Knochenmark. Die Tumorzellen, die ins Knochenmark eingedrungen sind, werden in der Literatur als disseminierte Tumorzellen (DTCs) bezeichnet. Die klinische Relevanz von Lymphknotenmetastasen oder DTCs als unabhängiger Marker für eine schlechte Prognose ist in der Medizin heutzutage weitgehend anerkannt (3). Wissenschaftliche Untersuchungen lassen zudem die Vermutung zu, dass DTCs über Jahre im Knochenmark überleben können, ohne vom eigenen Körperabwehrsystem zerstört zu werden oder weitere Metastasen auszubilden. Im Gegensatz dazu konnte für Tumorzellen, die sich im Blutsystem befinden, gezeigt werden, dass ein Großteil der CTCs nur eine sehr geringe Halbwertszeit aufweist und bereits nach 24 Stunden wieder verschwindet (4). Ferner wird angenommen, dass ein permanenter Zufluss von CTCs aus dem Tumor erfolgt, wodurch diese Zelltypen für die Überwachung des Krankheitsverlaufs von besonderer Bedeutung sein können, da das Blut den dynamischen Prozess der Tumorprogression auf zellulärer Ebene widerspiegeln kann. Basierend auf dieser Annahme sind Therapieerfolge und eine frühzeitige Tumorneubildung über einen wenig invasiven Eingriff (Blutentnahme) somit relativ leicht zu verfolgen.

Obwohl Tumorzellen im Blut zum ersten Mal bereits vor über 150 Jahren vom australischen Arzt Thomas Ashworth beobachtet wurden (5), gewinnt die Untersuchung dieser Zellen als neuartige Tumormarker auf Grund des technischen Fortschritts erst seit den letzten Jahrzehnten an wissenschaftlicher Bedeutung. So konnte über den Nachweis von CTCs aus Blutproben von Patienten mit metastasiertem Mamma-, Prostata- und Kolorektumkarzinom bereits ein Schwellenwert von 5 bzw. 3 Zellen pro 7,5 ml Blut vor dem Beginn einer Behandlung als unabhängiger prognostischer Faktor hinsichtlich der Länge der krankheitsfreien und der gesamten Überlebenszeit definiert werden (6-8). Im Rahmen der adjuvanten „SUCCESS-Studie“ wird ergänzend untersucht, ob der CTC-Status vor, während oder nach einer erfolgten Chemotherapie auch als „Erfolgskontrolle“ des Therapieverlaufs genutzt werden kann (9), wobei der Einsatz von CTCs als pharmakodynamische Marker in der neoadjuvanten Situation bereits aufgezeigt werden konnte (10).

Die molekulare Analyse der CTCs bietet den Wissenschaftlern zudem die Chance tiefere Einblicke in biologische Prozesse der Metastasierungskaskade zu erlangen. In naher Zukunft könnten CTCs somit neben ihrer Funktion als Diagnose-, Response- oder Prognosemarker auch als prädiktive Biomarker im klinischen Forschungsalltag eingesetzt werden, wodurch eine personalisierte Therapie der Krebspatienten denkbar wird. Bei der personalisierten Medizin wird der individuelle Krankheitszustand eines Patienten gewöhnlich über die Entnahme von Gewebeproben des Primärtumors genau charakterisiert und eine Behandlung weitestgehend auf diesen Zustand eingestellt. CTCs können möglicherweise als „flüssige Biopsie“ verwendet werden und somit das Ansprechen einer Therapie über die Analyse des Markerprofils spezifisch vorhersagen. Das CTC-Profil kann somit auch zur Reevaluierung therapierelevanter Marker genutzt werden, wobei der Eingriff über die Blutbahn überdies den Vorteil bietet, dass zusätzlich auch Patienten mit „nicht-biopsierbaren Tumoren“ charakterisiert werden können. Ausgehend von der geringen Anzahl an CTCs im Blut und des hohen Hintergrunds an normalen Blutzellen (etwa eine CTC auf bis zu 1x108 Blutzellen) müssen allerdings besondere Strategien gewählt werden, um CTCs spezifisch aus einer Blutprobe anreichern zu können. In der gegenwärtigen Krebsforschung werden daher verschiedene Verfahren zum Nachweis der Zellen angewendet und erprobt, die im Folgenden genauer erläutert werden.

Tumorzellanreicherung

Für eine effiziente Anreicherung der CTCs nach einer Blutabnahme können in der Regel die physikalischen oder die biologischen Eigenschaften der Tumorzellen genutzt werden (Abb. 1). In klinischen Studien werden vielfach antikörperbasierte Techniken für die positive Tumorzellselektion angewendet, wobei die CTCs meistens durch Antikörperbindung an das EpCAM-Protein selektiert werden. EpCAM ist ein membranständiges Glykoprotein, das bei einer Vielzahl von Karzinomen exprimiert wird und nicht auf normalen Blutzellen zu finden ist (11). Detektionsmethoden für CTCs wie der AdnaTest, der CTC-Chip, die CellSearchTM-Methode oder der neuartige Nanodetektor der Firma GILUPI basieren auf dem Prinzip der „epithelialen Selektion“ und erzielten bereits klinisch relevante Forschungsergebnisse (3). Neben der CTC-Sortierung über epitheliale Marker werden in der aktuellen Literatur allerdings auch weitere biologische Verfahren zur Anreicherung der CTCs diskutiert, da dieser Ansatz die Tatsache vernachlässigt, dass manche Tumorzellsubpopulationen im Verlauf der Migration ihre epithelialen Eigenschaften verlieren können und mesenchymale Zellphänotypen hervorbringen (12, 13). Dieser Differenzierungsvorgang wurde u.a. von Yang und Weinberg als epithelial-mesenchymale Transition (EMT) zusammengefasst und beinhaltet die Herunterregulation von epithelialen Markern wie z.B. EpCAM oder E-Cadherin, während mesenchymale Marker wie Vimentin oder N-Cadherin heraufreguliert werden (14). Der alleinige Nachweis von CTCs über die „epitheliale Selektion“ kann demnach leicht zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Alternativ zur „epithelialen Selektion“ können CTCs über die Abreicherung der CD45-positiven Leukozyten selektiert werden (negative Depletion). Über dieses Verfahren ließen sich bereits vitale Zellen im Blut von Krebspatienten aufspüren (15). Lebende CTCs lassen sich ebenfalls über den Vita Assay anreichern (16). Allerdings fehlt für diesen Assay die unabhängige Bestätigung der Funktionalität, da positive Befunde bislang lediglich in der medizinischen Abteilungen der Stony Brook Universität in New York (USA) beschrieben wurden. Ergänzende Untersuchungen könnten möglicherweise einen wichtigen Beitrag zur personalisierten Medizin leisten, da die molekulare Analyse aktivierter Signalwege von vitalen bzw. invasiven CTCs hilfreiche Indizien für die Wahl der Therapie liefern kann.

 

Abb. 1: Nach der Blutabnahme können CTCs über ihre physikalischen oder ihre biologischen Eigenschaften angereichert werden. Physikalische Eigenschaften beinhalten die Selektion über die Dichte, die spezifische elektrische Ladung oder die Zellgröße. Zu den biologischen Eigenschaften zählt die Expression der Oberflächenmarker wie z.B. EpCAM (positive Selektion) und CD45 (negative Depletion). Zudem können CTCs anhand der Invasivität aus einer Probe angereichert werden.
CTC=zirkulierende Tumorzelle; EpCAM=epithelial cell adhesion molecule;  Fluo-CAM=fluorescent cell adhesion matrix; Glyco A=Glycophorin A.

Neben den biologischen Eigenschaften lassen sich Tumorzellen alternativ auch über ihre physikalischen Eigenschaften aus den Blutproben der Krebspatienten selektieren. So können CTCs auch über die spezifische Dichte (z.B. Oncoquick oder FICOLL), die Zellgröße (ISET) oder charakteristische elektrische Ladungen angereichert werden (3). Vorteil dieser Strategie ist, dass die Zellen nicht über epitheliale Oberflächenproteine selektiert werden müssen, wodurch der Nachteil des Verlustes EpCAM-negativer Tumorzellpopulationen umgangen werden kann. Allerdings ist der Nachweis von CTCs im Blut von Krebspatienten über das Oncoquick-Verfahren im Vergleich zur positiven Tumorzellselektion (CellSearchTM-System) deutlich weniger sensitiv (17). Zudem fehlt für die CTC-Selektion über die Größe oder die elektrische Ladung die eindeutige Bestätigung der klinischen Relevanz in größeren Studien.

 

CellSearchTM

Obwohl verschiedene Nachweisverfahren für CTCs bereits kommerziell erhältlich sind, ist bis heute lediglich die CellSearchTM-Methode ein von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenes System zum Erfassen der CTCs im klinischen Alltag (Abb. 2). Beim CellSearchTM-Verfahren werden die CTCs in einem ersten Selektionsschritt über Antikörper gegen das Oberflächenprotein EpCAM angereichert (1. CTC: EpCAM+). Diese Antikörper sind mit Eisennanopartikeln (Ferrofluids) verbunden, wodurch sich eine nachfolgende Separation im magnetischen Feld durchführen lässt (CellTracks-AutoprepSystem). Eine Kern-, Keratin- und CD45-Immunfluoreszenzfärbung erlaubt anschließend die bildliche Darstellung der Tumorzellen am Mikroskop (CellTracksAnalyzer) (2. CTC: CK+, DAPI+ (4,6-diamino-2-phenylindole), CD45–). Unter Verwendung der CellSearchTM-Methode konnte bereits im Jahr 2004 ein Grenzwert von 5 Zellen identifiziert werden, um eine Gruppe von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom mit guter von einer Gruppe mit ungünstiger Prognose zu unterscheiden. Metastasierte Brustkrebspatientinnen mit 5 und mehr CTCs pro 7,5 ml Blut hatten im Gegensatz zu Patientinnen mit weniger als 5 Zellen eine signifikant verkürzte progressionsfreie Überlebenszeit (6). Entsprechende Resultate konnten über dieses Verfahren auch für Krebspatienten mit metastasiertem Prostata- und Kolorektalkarzinom beobachtet werden, wobei der Grenzwert für eine ungünstige Prognose beim Kolorektalkarzinom bei 3 Zellen pro 7,5 ml Blut lag (7, 8). Obwohl für das Prostatakarzinom auch PSA als diagnostischer Biomarker im Blut eingesetzt werden kann, bietet lediglich die Kombination aus PSA- und CTC-Analyse über das CellSearchTM-System eine verbesserte Einschätzung hinsichtlich der Prognose. Ferner lassen sich nur über das CTC-Profil entscheidende Informationen für die Wahl der individuellen Therapiestrategie gewinnen (19). Aktuell wird das CellSearchTM-Verfahren auch in zwei groß angelegten klinischen Studien zum spezifischen Nachweis der CTCs angewendet, um den Stellenwert der Tumorzellen im Blut weiter aufzuklären (9, 20).

 

           

Abb. 2: Mit Hilfe der CellSearchTM-Methode kann die Anzahl von Tumorzellen epithelialer Herkunft im Blut eines Patienten quantitativ und halbautomatisiert nachgewiesen werden. Das Verfahren wird in 2 Schritten unter Verwendung des CellTracksAutoprepSystems und des CellTrackAnalyzers II durchgeführt. (a) Die Prozedur zum Nachweis der CTCs beinhaltet im ersten Schritt die Selektion der Zellen über Antikörper gegen das Oberflächenprotein EpCAM. (b) Im zweiten Schritt können die angereicherten und bereits angefärbten Zellen am Computerbildschirm bildlich dargestellt und automatisiert ausgezählt werden. CTCs sind charakterisiert durch folgende Merkmale: (EpCAM+), CK+, DAPI+, CD45–.
CK=Cytokeratin; CTC=zirkulierende Tumorzelle; DAPI=4,6-diamino-2-phenylindole; EpCAM=epithelial cell adhesion molecule.

 

Tumorzelldetektion

Der Nachweis von CTCs nach einer erfolgten Anreicherung kann z.B. über einen PCR-basierten (polymerase chain reaction) Ansatz erfolgen. Die PCR-Technologie bietet den Vorteil, dass sich die Tumorzellen über die Amplifikation humaner Gentranskripte molekularbiologisch weitreichend charakterisieren lassen. Über die molekularbiologische Analyse kann neben dem Mutationsstatus auch ein Einblick in aktivierte Signalwege der Zellen gewonnen werden, was die CTCs im Vergleich zur freien Plasma-RNA bzw. -DNA als prädiktive Biomarker in klinischen Studien unentbehrlich macht. Die molekulare Analyse der aktivierten Signalwege kann entscheidende Informationen für die richtige Wahl der Therapiestrategie liefern, wodurch möglicherweise eine effektive Verbreitung der Tumorzellen im Körper der Patienten verhindert werden kann. Aufgrund der außerordentlich hohen Sensitivität der PCR können Kontaminationen der Proben jedoch leicht zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Zudem lässt sich die Anzahl der CTCs in der Probe nicht eindeutig quantifizieren, was die Darstellung des Therapieerfolgs möglicherweise negativ beeinflussen kann. Ferner ist über dieses Verfahren nicht auszuschließen, dass auch Signale von apoptotischen Zellen amplifiziert werden.

Um das Problem der Quantifizierbarkeit zu umgehen, können für den Nachweis der CTCs immunzytochemische Färbemethoden (ICC) gewählt werden. CTCs werden bei diesem Ansatz geläufig als kernhaltige Zellen definiert, die über die Expression epithelialer Marker, wie die der Keratine (CK-8, -18 und -19) im Blut der Krebspatienten detektiert werden. Ergänzend erfolgt in der Regel ein Ausschluss der Leukozyten über eine Markierung der CD45-Expression (siehe CellSearchTM-System auf S. 392). Zum direkten Nachweis von vitalen CTCs kann nach einer Tumorzellanreicherung der EPISPOT (EPithelial ImmunoSPOT) angewendet werden. Lebensfähige CTCs lassen sich bei diesem Verfahren anhand von Proteinen detektieren, die spezifisch von Tumorzellen sezerniert oder abgespalten werden. So ließen sich bereits CTCs und DTCs über die charakteristischen Marker wie CK-19, MUC1 (Mucin-1), PSA (prostataspezifisches Antigen) oder den Stammzellwachstumsfaktor FGF-2 (fibroblast growth factor 2) in Patienten mit Brust-, Prostata-, Kolon- oder Kopf-Hals-Karzinomen sowie Melanomen nachweisen (18). Obwohl der EPISPOT demnach eine interessante Alternative zum Nachweis von lebenden Tumorzellen erlaubt, müssen größere klinische Studien die Relevanz dieser Methode weiter aufklären.

Schlusswort

CTCs können einen bedeutenden Beitrag zur verbesserten Krebsdiagnose und zu einer effizienteren Überwachung des Therapieerfolgs im onkologischen Forschungsbereich leisten. Ergänzend haben CTCs das Potenzial, als „flüssige Biopsie“ verwendet zu werden und können so eine Alternative zur herkömmlichen Charakterisierung von Tumorzellen aus Gewebeproben sein. Da Metastasen im klinischen Alltag nicht routinemäßig biopsiert werden, können die CTCs somit ein molekulares Abbild des aktuellen Tumorprofils aufzeigen, ohne dass ein invasiver Eingriff durchgeführt werden muss. Bis heute hat lediglich das CellSearchTM-System von der US-amerikanischen FDA die Zulassung zum Nachweis der CTCs erhalten können. Über dieses System lassen sich CTCs halbautomatisiert und reproduzierbar im Blut der Krebspatienten nachweisen. Ferner kann über dieses standardisierte Verfahren in der metastasierten Situation eine Patientenkohorte mit guter von einer Gruppe mit ungünstiger Prognose unterschieden werden (6-8).

Aktuell erfolgt im Rahmen der groß angelegten „SUCCESS-Studie“ die Untersuchung, ob CTCs vor, während oder nach einer erfolgten adjuvanten Chemotherapie zur Kontrolle des Therapieverlaufs beim Mammakarzinom eingesetzt werden können (9). Da die molekularbiologische Charakterisierung der CTCs zum Zeitpunkt der Metastasierung auch möglicherweise eine Reevaluation des Tumorzellphänotyps erlaubt, bietet das CellSearchTM-System über einen freien Fluoreszenzkanal auch die Möglichkeit weitere Marker für die Nutzung einer personalisierten Medizin zu identifizieren. Hier sind insbesondere das HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) Onkogen und der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor receptor) als etablierte Therapiezielmoleküle in der Onkologie von großem Interesse.

Obwohl die zirkulierenden Tumorzellen im Blut bereits als diagnostische und prognostische Marker im klinischen Alltag eingesetzt werden können (3), ließ sich bisher allerdings noch kein „Goldstandard“ für den gesicherten Nachweis der gesamten Tumorzellpopulation im Blut der Patienten etablieren. Aufgrund der Heterogenität der Tumorzellen und EMT-kennzeichnenden Prozessen, die im Verlauf der Metastasierung auftreten können (12, 13, 14), können über die alleinige „epitheliale Selektion“ manche Tumorzellpopulationen verloren gehen. Ausgehend von dieser Erkenntnis müssen derzeitige Verfahren zur Anreicherung bzw. zum Nachweis der CTCs im klinischen Forschungsbereich noch verbessert werden. Die physikalische Anreicherung über die Zelldichte, die Zellgröße oder die spezifische elektrische Ladung kann möglicherweise dabei helfen, EpCAM-negative Tumorzellsubpopulationen zu detektieren.

Allerdings müssen die Sensitivität und die Spezifität dieser Verfahren erhöht und die klinische Relevanz der über diese Methoden detektierten CTCs in größere Studien gezeigt werden. Neben den physikalischen Eigenschaften kann das Spektrum der Tumorzellpopulationen möglicherweise über die negative Depletion (15) oder die Verwendung von EMT-kennzeichnenden Antikörpercocktails erweitert werden. Ein Marker, der sowohl auf allen epithelialen als auch auf allen mesenchymalen CTC-Populationen zu finden ist, ist bisher allerdings nicht verfügbar.

Obwohl hinsichtlich der Nachweismethode für CTCs noch einzelne Optimierungen durchgeführt werden müssen, bieten CTCs einen viel versprechenden Ansatz als neue Bio-marker in der Krebsforschung. Die Verfügbarkeit einer FDA-zertifizierten und automatisierten Methodik hat darüber hinaus zu einer wichtigen Standardisierung und Qualitätsverbesserung des CTC-Nachweises geführt. Die bisherigen Studienergebnisse sind sehr ermutigend und die Resultate der laufenden Studien (derzeit werden CTC-Messungen weltweit in mehr als 400 klinischen Studien eingesetzt) werden dabei helfen, den Stellenwert der CTCs im klinischen Alltag weiter aufzuklären.

 

 

 

Prof. Dr. med. Klaus Pantel

Institut für Tumorbiologie, Gebäude N27, 4 OG,
Martinistraße 52
Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf
20246 Hamburg

Tel.: 040/7410-53503
Email: pantel@uke.uni-hamburg.de

 

Abstract

T. M. Gorges, S. Riethdorf, K. Pantel, Institut für Tumorbiologie, Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf

Due to the high mortality rate caused by cancer metastasis there is an urgent need to find new biomarkers, which should be able to detect early tumor cell dissemination and monitor the efficacy of systemic therapy against metastatic cells in a timely manner. The analysis of circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood might provide beneficial information for the clinical management of cancer therapy, probably far earlier than the present high resolution imaging technologies. CTCs can be used for diagnostic and prognostic purposes and are also discussed to be suitable as predictive markers. Although many different approaches have been developed that reliably detect and enumerate CTCs, until now just one method (CellSearchTM System) has been cleared by the American Food and Drug Administration (FDA). Ongoing clinical studies focus on the use of CTCs as biomarkers for guiding therapy decisions in individual cancer patients.

Keywords: Biomarker, metastasis, blood, circulating tumor cells, disseminated tumor cells, epithelial-mesenchymal transition, breast cancer, prostate cancer, colon cancer

 

Literaturhinweise:
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