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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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07. Dezember 2016

Vereinzelung von CTCs: Automatisierung bringt entscheidenden Vorsprung in der Krebstherapie

T. Schunck, M. Baßler, A. Winkler, Fraunhofer ICT-IMM, Mainz.

Der Verlauf von Krebserkrankungen ist kaum vorhersagbar und die Prognose für den Patienten daher oft unklar. Obschon man weiß, dass jeder Patient anders auf ein und dieselbe Therapie reagiert, ist es bisher dennoch schwer, daraus die richtigen Schlüsse zu ziehen. Die Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen am Fraunhofer ICT-IMM haben ein vollautomatisiertes System für die „Liquid Biopsy“ zur Isolierung einzelner Tumorzellen (CTCs) aus Patientenblut entwickelt. Das System versetzt Krebsforscher in die Lage, CTCs individueller Patienten zu gewinnen und an diesen Krankheitsverläufe zu studieren und Therapieansätze zu entwickeln. Es wird erwartet, dass die Analyse einzelner CTCs in einigen Jahren in der patientennahen Therapie genutzt werden kann.
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Chemotherapie und Bestrahlung sind sehr belastend für den Körper – umso interessanter ist demnach sowohl für die Patienten als auch für die Behandelnden die Information, ob die Therapie die gewünschte Wirkung zeigt. Im Blut zirkulierende Tumorzellen werden in der Krebsforschung als wichtige Quelle für Informationen über den Krankheitsfortschritt und mögliche Therapieansätze gesehen. Diese aus Standard-Blutproben gewonnenen Tumorzellen geben schon wenige Stunden nach einer Chemo- oder Radiotherapie Auskunft über den Erfolg der Behandlung (1). In Anlehnung an die klassische Gewebe-Biopsie bezeichnet man dieses Vorgehen daher als Flüssigbiopsie (Liquid Biopsy). In Zukunft möchten Ärzte anhand der Liquid Biopsy im Rahmen der sogenannten personalisierten Medizin die Therapie auf den individuellen Patienten abstimmen (2). Unser CTCelect-System ermöglicht es Krebsforschern erstmals, jede einzelne Tumorzelle in der Blutprobe vollautomatisch zu isolieren, so dass anschließend ihre genetischen und molekularbiologischen Eigenschaften untersucht werden können. Es kann beispielsweise mittels Einzelzellsequenzierung die vollständige genetische Information des Genoms und des Transkriptoms erhalten werden (3, 4). So kann untersucht werden, wie die verschiedenen Tumortypen auf eine Behandlung reagieren und Medikamente dafür gezielt entwickelt werden. Denn man weiß: einige Tumore „reagieren“ auf eine Chemotherapie oder eine Bestrahlung mit Anpassungen an die neue Situation, z.B. durch die Ausbildung von Resistenzen gegen die Chemotherapeutika. Durch die vergleichsweise hohe Proliferations- und Mutationsrate der entarteten Zellen kommt es dabei zu einer schnellen Anpassung an einen Selektionsdruck wie ihn beispielsweise ein Chemotherapeutikum darstellt. Frei nach dem Begriff des „survival of the fittest“ überlebt und vermehrt sich die am besten angepasste Mutation (5).

 

Abb. 1: CTCelect-System. (Zur Verfügung gestellt vom Fraunhofer ICT-IMM)
Abb. 1: CTCelect-System.


Die Ausgangslage

Bereits bei Vorliegen von mehr als 5 Tumorzellen in einer 7,5 ml Blutprobe gilt die Krankheit als nicht besiegt und die Prognose für die Betroffenen ist trotz Chemotherapie dramatisch schlechter als für Patienten mit einer geringeren Anzahl von Tumorzellen im Blut (6). Aus diesem Grund ist eine möglichst vollständige Detektion der CTCs überlebenswichtig für die Patienten. Da sich in einer Probe mehr als 30 Milliarden Zellen befinden, entspricht die Isolation der Tumorzellen der sprichwörtlichen Suche nach der Nadel im Heuhaufen.

Verschiedene Systeme erlauben heutzutage bereits die Bestimmung der Anzahl der CTCs in einer Blutprobe. Das einzige bislang von der amerikanischen FDA zugelassene System CellsearchTM der Firma Janssen Diagnostics liefert von den identifizierten Zellen jeweils eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme. Die abgebildeten Zellen stehen allerdings für weitergehende Analysen nicht mehr zur Verfügung. Durch die Differenzierung der Zellen innerhalb eines Tumors und durch die hohe Mutationsrate der entarteten Zellen sind selbst die Zellen eines einzelnen Tumors sehr divers. Diese Diversität erschwert die genaue genetische Untersuchung und somit auch die Entwicklung neuer Medikamente. Daher reichen Nachweis und Tumorzellzahl alleine für die Forschung nicht aus. Der Wunsch von Forschern und Medizinern gleichermaßen ist die Verfügbarkeit vereinzelter Krebszellen, so dass diese genetisch und molekularbiologisch genau untersucht werden können. Bisher wird diese Zellvereinzelung manuell durchgeführt. Dieser Vereinzelungsschritt ist sehr zeitaufwändig und benötigt viel händisches Geschick. Die Handarbeit stellt unter dem Strich die größte Fehlerquelle bei der Isolation dar, indem oft auch mehr als eine Zelle gleichzeitig isoliert wird oder Zellen übersehen werden. Da nun allerdings bereits 5 Zellen von hoher diagnostischer Relevanz sind und diese zusätzlich noch alle unterschiedlich sein können, müssen für zuverlässige Analysen möglichst alle Zellen gefunden werden.

 
Abb. 2: Reagenzienkarussell für die automatische Anreicherung von CTCs und Halterung für die Aufnahme der mikrofluidischen Kartusche für die Einzelablage von CTCs. (Zur Verfügung gestellt vom Fraunhofer ICT-IMM)
Abb. 2: Reagenzienkarussell für die automatische Anreicherung von CTCs und Halterung für die Aufnahme der mikrofluidischen Kartusche für die Einzelablage von CTCs.


 
Weitere Möglichkeiten

Das Prinzip der Durchflusszytometrie wird allerdings nicht nur für zirkulierende Tumorzellen genutzt. Die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler bei uns am ICT-IMM haben jenseits des ursprünglichen Projekts weiter geforscht: Die Anwendungsgebiete reichen von der Wasseranalytik über Diagnostik- und Life-Science-Anwendungen über Routinetests in der Hämatologie, der Infektiologie und der Immunologie. Ein Beispiel ist die erfolgreiche Zusammenarbeit mit der Schweizer Firma rqmicro. In vielen Ländern ist durch Legionellen verseuchtes Trinkwasser keine Seltenheit. Selbst in Deutschland gab es in den letzten Jahren einige Fälle. Die stäbchenförmigen Bakterien fühlen sich besonders in Warmwasserleitungen bei 25 bis 40 °C wohl. Ist ihre Konzentration im Wasser zu groß und gelangen sie als Aerosol, z.B. beim Duschen, in die Atemwege, so können sie die sogenannte Legionärskrankheit auslösen, eine potentiell tödliche Lungenentzündung. Was also tun, wenn man seine eigenen Wasserleitungen überprüfen möchte? Bislang lautet die Antwort: Probe nehmen, ins Labor schicken, mindestens 10 Tage auf das Ergebnis warten. „Mit unserem System erhalten wir die Analyse in einer Stunde“, kontert Baßler. Wenn rqmicro das Gerät in etwa einem Jahr auf den Markt bringt, können Labore für Hausverwalter, Eigentümer oder Handwerker diese Analyse von der Probennahme bis zum Ergebnis in wenigen Stunden durchführen.



Das Verfahren

Dieser Herausforderung haben sich die Forscherinnen und Forscher bei uns am ICT-IMM gestellt und haben im Rahmen des Ci3 Clusters für Individualisierte Immunintervention ein Durchflusszytometer mit integriertem Einzelzelldispenser entwickelt (CTCelect), mit dem in einem zweistufigen Verfahren einzelne Krebszellen aus einer Vollblutprobe isoliert und vereinzelt werden können. Das System wurde bisher schon hinsichtlich der Extraktionseffizienz sowie der Minimierung des Beifangs, das heißt, auf die Minimierung der Wahrscheinlichkeit, dass sich neben der Zielzelle fälschlicherweise eine weitere Zelle im Reaktionsgefäß befindet, optimiert. Dazu wurden 2 etablierte Methoden auf neuartige Weise miteinander kombiniert und so ein einzigartiges System geschaffen.

Im ersten Schritt werden die Tumorzellen mittels immunomagnetischer Separation (IMS) aus der Probe „gefangen“ und in ein kleineres Probenvolumen überführt. Dabei werden die Tumorzellen zunächst unter Nutzung spezifischer Eigenschaften der Zelloberfläche gezielt mit magnetischen Partikeln gekoppelt und mit Magnetfeldern aus der Blutprobe extrahiert. Nach der Optimierung des Ablaufs können mit diesem Prozess nun 93% der Tumorzellen reproduzierbar aus Vollblut angereichert werden. Dabei ermöglicht der Prozess ausgehend von 7,5 ml Vollblut eine deutliche Volumenreduktion auf 500 µl gepufferte Zellsuspension – eine in der anschließenden Mikrofluidik sehr gut handhabbare Menge. In der Zellsuspension befindet sich aber zusätzlich zu den CTCs noch ein Hintergrund aus bis zu 8.000 Nicht-Krebszellen – vorwiegend weiße Blutkörperchen –, was eine genaue molekularbiologische Untersuchung der Tumorzellen nahezu unmöglich macht. Im zweiten Schritt wird der Extrakt anschließend zur Entfernung des unspezifischen Zellhintergrundes in eine mikrofluidische Kartusche überführt, in der die zuvor im System spezifisch fluoreszent markierten Krebszellen durchflusszytometrisch erkannt werden. In der Kartusche wird mittels einer hydrodynamischen Fokussierung der Probe eine nahezu ideale Vereinzelung der Zellen erreicht. Nach Erkennen einer Tumorzelle im Mikrokanal werden die einzelnen Zielzellen gezielt mittels eines Druckstoßes direkt in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte dispensiert. Auf diese Weise werden die Tumorzellen effizient vom Beifang der weißen Blutzellen getrennt. Denn entscheidend für eine aussagekräftige Genomsequenzierung an vereinzelten Tumorzellen ist die Reinheit der Zellen. In unserem Verfahren liegt die Wahrscheinlichkeit dafür, dass sich neben einer Tumorzelle in der Kavität der Mikrotiterplatte fälschlicherweise eine weiße Blutzelle befindet bei unter 10% (für 2 Zellen sinkt dieser Wert schon auf unter 1%). Durch Variation der hydrodynamischen Fokussierung kann die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination weiter verringert werden – dadurch verlängert sich aber die Laufzeit der gesamten Probenprozessierung. Genomische Einzelzellanalytik verliert zwar im Fall der Kontamination durch eine weitere Zelle an Empfindlichkeit, dennoch kann noch eine Vielzahl an wertvollen Erkenntnissen gewonnen werden. Hier müssen weitere Untersuchungen zeigen, bei welcher Wahl der Extraktionsparameter optimale Ergebnisse im Sinne der Tumorforschung erzielt werden können. In der mikrofluidischen Einzelzelldispensierung erreichen wir eine Ausbeute an Tumorzellen von 80%, wobei die verbleibenden Zellverluste vorwiegend durch Anhaftung an Oberflächen verursacht werden. Derzeit arbeiten wir an weiteren Verbesserungen des Verfahrens, um diese Verluste weiter zu reduzieren. Beide Schritte zusammengenommen ist es uns gelungen, eine hervorragende Zellausbeute von der Vollblutprobe bis hin zur Einzelzelldispensierung von über 75% zu realisieren.

Um ein solches System optimal auf dem Markt positionieren zu können, haben wir in der Entwicklung von vorneherein darauf geachtet, dass in der Systemauslegung kostengünstige Komponenten eingesetzt wurden. Dies ist uns gelungen, indem wir z.B. die optischen Komponenten des Systems in preisgünstige Spritzguss-Kunststoffkartuschen integriert haben. Die Fluoreszenzanregung und die Detektion erfolgen zudem mit einem leicht zu integrierenden, selbstjustierenden optischen Zugang zur Kunststoffkartusche, sodass ein einfacher Austausch der kontaminierten Teile vor jeder Analyse möglich ist. Dadurch entfallen zeit- und kostenträchtige Kalibrations- und Reinigungsschritte. Das kompakte und kostengünstige OEM-Design ermöglicht den Aufbau einer neuen Generation von Pipettierköpfen für den wachsenden Markt von Zellexperimenten sowie die Integration in Geräte für die schnelle vor-Ort-Analytik. Denn ein weiterer Vorteil ist die erfolgreiche Miniaturisierung des Zytometers. Wir haben es auf die Größe eines Schuhkartons verkleinert und neben den Kosten auch den Platzbedarf reduziert, so dass unser System auch in oft mit vielen Geräten bestückten Forschungslaboren untergebracht werden kann.

Somit konnte ein neuartiges, kostengünstiges System entwickelt werden, dass reproduzierbar und mit hoher Wiederfindungsrate Krebszellen aus Blut fängt und diese einzeln ablegt.


Ausblick

Mit dieser Ausbeute können Blutproben mit klinisch relevanter Tumorzellzahl bearbeitet werden. Aufgrund der nachgewiesenen Qualität der Zellen, dem kompakten Gesamtsystem und dem automatisierten Ablauf hat dieser Prozess das Potential, künftig standardisiert eingesetzt zu werden. Dies ermöglicht Forschern nun erstmals die voll automatisierte Vereinzelung von Tumorzellen aus Blut und wird die Untersuchungen an Einzelzellen fundamental vereinfachen und verbessern. Dann können die untersuchten Zellen Antworten geben, die den weiteren Therapieverlauf beeinflussen können. Unter anderem können die Wissenschaftler den Zelltyp und einen etwaigen Tumorsubtyp bestimmen oder nach Genveränderungen suchen. Alles Hinweise darauf, wie der Tumor auf die aktuelle Behandlung anspricht. Sollten die gewünschten Veränderungen nicht eintreten, kann man sofort mit einer Anpassung der Therapie reagieren. Diese Analyse direkt im Anschluss an beispielsweise eine Chemotherapie, könnte in Zukunft zeitnahe Rückschlüsse zulassen und könnte somit den entscheidenden Vorteil im Kampf gegen den Krebs bedeuten.


 

Tobias Schunck
Dr. rer. nat. Tobias Schunck

Fraunhofer ICT-IMM
Carl-Zeiss-Str. 18-20
55129 Mainz

Tel.: 06131/990-492
Fax: 06131/990-205
E-Mail: Tobias.Schunck@imm.fraunhofer.de











 
Michael Baßler Dr. rer. nat. Michael Baßler

Fraunhofer ICT-IMM
Carl-Zeiss-Str. 18-20
55129 Mainz

Tel.: 06131/990-399
Fax: 06131/990-205
E-Mail: Michael.Bassler@imm.fraunhofer.de
 
ABSTRACT

T. Schunck, M. Baßler, A. Winkler, Fraunhofer ICT-IMM, Mainz
 

The progression of cancerous diseases can barely be predicted and thus the forecast for the patient often is uncertain. Although we know that every patient responds differently to the same treatment it is still hard to draw the right conclusions from this. The scientists at Fraunhofer ICT-IMM have developed a fully automated system for the liquid biopsy in order to isolate single tumor cells (CTCs) out of a patient’s blood. The system enables cancer researchers to gain CTCs from individual patients, to study the history of their disease and to develop therapeutic approaches. It is expected that the analysis of single CTCs can be utilized for personalized patient therapy in a few years.
 

Keywords: liquid biopsy, single tumor cells, CTCs, blood
Literatur:
(1) Alix-Panabières C, Pantel K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin Chem 2013; 59(1):110-118.
(2) Toss A, Mu Z, Fernandez S et al. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann Transl Med 2014;2(11):108.
(3) Gawad C, Koh W, Quake SR. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat Rev Gen 2016;17:175-188.
(4) Liu S, Trapnell C. Single-cell transcriptome sequencing: recent advances and remaining challenges. F1000Res 2016; 5: F1000 Faculty Rev-182.
(5) Khong HT1, Restifo NP. Natural selection of tumor variants in the generation of „tumor escape“ phenotypes. Nat Immunol 2002;3(11):999-1005.
(6) Pressemitteilung zur 33. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Senologie (DGS); Zirkulierende Tumorzellen im Blut: Verändert der CTC-Test Prognosen und Therapien? Veröffentlicht am 27.06.2013.
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