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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel

15. Februar 2018 „Bei der Liquid Biopsy kommt es auf das Wann und Wie an“

Interview mit Dr. Markus Falk, Abteilung Forschung und Entwicklung in der Molekularpathologie.

JOURNAL ONKOLOGIE sprach mit dem Molekularbiologen Dr. Markus Falk über ganz praktische Fragen zum Thema Liquid Biopsy – z.B. präanalytische Fallstricke bei Probenabnahme und Transport, welches Material sich für eine Testung eignet und ob sich die Falsch-negativ-Rate künftig weiter senken lässt.
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Markus Falk
JOURNAL ONKOLOGIE: Kann man eine Liquid Biopsy auch an einer Liquor-Probe durchführen – oder ist die praktische Durchführung nur auf Blutplasma ausgelegt?
 
FALK: Eine relevante Frage, die wir zum Teil auch mit den Klinikern diskutieren. Grundsätzlich ist eine Liquid Biopsy an Liquor möglich, wir konnten so bereits einige Male erfolgreich Therapie-relevante Mutationen nachweisen. Dies kann bei z.B. schwer zugänglichen Hirnmetastasen oder fraglicher ZNS-Beteiligung der Erkrankung eine Erweiterung der diagnostischen Möglichkeiten darstellen. Allerdings gilt dies nur bei meningealem Befall und nur sehr eingeschränkt bei tieferem zentralen Befall.

Die Plasma-Röhrchen zur Stabilisierung zellfreier Tumor-DNA (z.B. von Streck oder Roche) sind eigentlich für die Testung von Blutproben ausgelegt. Sie verhindern die Lyse von Leukozyten, und so das Austreten von Wildtyp-DNA. Aber auch Liquor-Zellen lassen sich in Plasma-Röhrchen fixieren – ein günstiger Nebeneffekt, denn diese Zellen sind extrem kurzlebig mit einer Halbwertzeit von wenigen Stunden. Häufig ist anhand unfixierter, nativer Zellen im Liquor keine valide Mutationsanalyse möglich. Durch die Verwendung der Plasma-Röhrchen lässt sich sowohl DNA aus den fixierten Tumorzellen als auch zellfreie Liquor-DNA zur Mutationsanalyse gewinnen. Das Röhrchen muss allerdings mit 0,9%iger NaCl-Lösung aufgefüllt werden, da in der Regel nur 2 ml Liquor entnommen werden können.
 
 
JOURNAL ONKOLOGIE: Man hört immer wieder, dass die Mutationsanalyse an der Liquid Biopsy ein negatives Ergebnis – d.h. Wildtyp – zeigt, obwohl klinisch klar ist, dass der Patient z.B. Hirnmetastasen entwickelt hat. Kann das an der Probenentnahme oder am Transportweg liegen? Sind falsch-negative Ergebnisse ein häufiger auftretendes Phänomen?
 
FALK: Die Beantwortung dieser Frage ist etwas komplexer, weil es unterschiedliche Gründe geben kann, warum das Testergebnis falsch-negativ ist. Wenn die entsprechenden Fixierungsröhrchen verwendet werden, sollte der Transport kein Problem sein, da die Probe bis zu einer Woche bei Raumtemperatur stabil ist.
 
Das Blut muss aber mit den richtigen Adaptern (spezielle Butterfly-Adapter, z.B. der Firma BD) abgenommen werden, um Hämolyse zu verhindern. Die Röhrchen müssen außerdem mit dem passenden Volumen an Vollblut (8-9 ml/Röhrchen) aufgefüllt werden, sonst „schwappt“ das Blut beim Transport hin und her und es kommt zur Hämolyse durch mechanische Beanspruchung. Dadurch wird Wildtyp-DNA aus den Leukozyten frei, welche die an sich schon gering konzentrierte Tumor-DNA noch weiter verdünnt.
 
Zusätzlich zu diesen präanalytischen „Fallstricken“ gibt es aber weitere Faktoren, die ein falsch-negatives Ergebnis begünstigen können:
 
Entscheidend ist, dass sensitive molekulargenetische Testverfahren eingesetzt werden. Viele diagnostische Institute arbeiten noch mit der Sanger-Sequenzierung, dies reicht für den Mutationsnachweis an der Liquid Biopsy nicht aus. Die Verwendung real-time PCR-basierter Methoden (z.B. cobas® oder Amoy-kit) ist das Minimum, besser ist die Verwendung noch sensitiverer Methoden („limit of detection“ von < 1%) wie Hybrid-capture NGS oder der Digital-PCR. Wir wissen aus eigener Erfahrung, dass man durch eine hohe Testsensitivität die Falsch-negativ-Rate in etwa halbieren(!) kann.
 
Ein weiterer, klinischer Faktor ist die Frage nach dem richtigen Zeitpunkt der Liquid-Biopsy-Testung: Die Liquid Biopsy eignet sich am besten bei schnellem Tumorprogress unter TKI-Therapie. Je höher die Tumorlast, je größer der Tumor, und je höher die Anzahl an Metastasen und je fortgeschrittener das Tumorstadium, desto „besser“, da sich dann umso mehr Tumor-DNA im Blut findet. Daher gilt der Konsens, die Liquid Biopsy zu untersuchen, wenn ein Therapiewechsel klinisch notwendig wird und eine Re-Biopsie zur Rezidiv-Analyse erwogen wird.
 
Zur Veranschaulichung ein Beispiel: Ein Patient unter EGFR-TKI zeigt raschen Tumorprogress bei hoher Tumorlast, die Transport-Logistik und Präanalytik waren adäquat, die Mutationsanalyse am Blutplasma (ctDNA) erfolgte mittels Digital-PCR oder Hybrid-capture NGS. Daraus resultiert eine annähernd 100%ige Sicherheit, anhand der Liquid Biopsy zum richtigen Ergebnis – im Vergleich zur Tumorbiopsie – zu kommen. Wenn aber z.B. nur eine von mehreren Hirnmetastasen mäßig progredient ist und der Primärtumor oder andere Metastasen gar nicht wachsen, dann ist die Wahrscheinlichkeit, im Blutplasma eine Resistenz-Mutation wie z.B. EGFR T790M zu finden, schon deutlich geringer. Kommen dann noch andere der genannten Faktoren dazu, kann dies schnell zu „falsch-negativen“ Ergebnissen führen. Deshalb gilt trotz der großen Aufmerksamkeit um die Liquid Biopsy immer noch die Einschätzung, dass sie nur dann zum Einsatz kommen sollte, wenn kein solides Tumormaterial zu bekommen ist oder wenn der Patient eine erneute Tumorbiopsie ablehnt.
 
 
JOURNAL ONKOLOGIE: Können Sie einen Ausblick geben, welche Diagnostik- und Monitoring-Technologien in naher Zukunft möglich werden?
 
FALK: Bereits jetzt bieten moderne Sequenziertechnologien die Möglichkeit, anhand der Liquid Biopsy eine umfassende Rezidiv-Analyse durchzuführen. Es ist wichtig, neben Punktmutationen wie EGFR T790M auch Amplifikationen wie MET, EGFR und weitere der vielfältigen Resistenzmechanismen zu untersuchen, um dem Onkologen auch in der Rezidiv-Situation eine breite Basis zur Therapieentscheidung bieten zu können.
 
PCR-Methoden wie die Digital-PCR sind zwar noch sensitiver als das herkömmliche NGS (mind. um den Faktor 10-100), mit ihr kann aber nicht das gesamte Resistenzspektrum abgedeckt werden.
 
Wir erwarten, dass sich die Sequenziertechnologien rasch weiterentwickeln werden. In wenigen Jahren wird man routinemäßig in der Lage sein, sehr komplexe genetische Untersuchungen in kürzester Zeit, d.h. innerhalb von wenigen Stunden, durchzuführen. Technisch wird es dann möglich sein, Gesamtgenom-Analysen inklusive des epigenetischen Status (z.B. der Promotor-Methylierung) in einem realistischen Zeit- und Kostenrahmen durchzuführen.
 
Neuere Technologien („Single Molecule Sequencing“) kommen bereits ohne PCR-Schritt vor der Sequenzierung aus, was den Arbeitsablauf von zurzeit einigen Tagen auf wenige Stunden reduzieren wird. Der Zeitraum bis zur Befunderstellung wird sich dadurch weiter reduzieren, ein wichtiger Faktor beim Therapiemanagement. Dies wird sowohl zur Abstimmung der molekular stratifizierten Therapie als auch der Immuntherapie (Stichwort „Tumor Mutational Burden“, TMB) hilfreich sein.
 
So sensitiv die Methoden künftig allerdings auch werden mögen, bei der Liquid Biopsy-Analyse gibt es noch eine Limitation biologischer Natur: Nur bei Tumoren, die generell in der Lage sind DNA ins Blut abzugeben, kann man anhand der Liquid Biopsy auch ein entsprechendes molekulargenetisches Ergebnis erwarten. Auch noch so genaue Methoden werden die Sensitivität der Liquid Biopsy von etwa 80% bei Lungenkarzinom in Zukunft nicht entscheidend erhöhen können. Wir werden demnach – trotz technischer Fortschritte – zumindest bei nicht-selektionierten Patienten auf lange Sicht mit einer Falsch-negativ-Rate von etwa 20% (beim metastasierten Lungenkarzinom oder beim Kolorektalkarzinom) leben müssen. Dennoch wird die Bedeutung der Liquid Biopsy als minimal-invasive Methode zum Monitoring der minimalen Resterkrankung (MRD) bei soliden Tumorerkrankungen mit Sicherheit weiter zunehmen.


Vielen Dank für das Gespräch!

ab


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