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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel

24. Juni 2019
Seite 1/2
AML: Klinische Bedeutung von Spleißvarianten und Spleiß-assoziierten Genmutationen

M. Janning, W. Fiedler. II Medizinische Klinik für Hämatologie, Onkologie und Knochenmarkstransplantation mit Sektion Pneumologie, Universitäres Cancer Center Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine der ersten Tumorerkrankungen, deren Genom sequenziert wurde. Bei der AML haben uns die systematischen Analysen u.a. mittels Next Generation Sequencing (NGS) ein breites und tieferes Verständnis auf Genomebene vermittelt. Sie haben z.B. auch gezeigt, dass die AML im Vergleich zu anderen Tumoren eine deutlich geringere Menge an somatischen Mutationen aufweist. Basierend auf diesen Daten konnten die Risikostratifizierung verbessert und bereits neue, zielgerichtete Therapien gegen mutierte Proteine entwickelt werden. Wir haben auch gelernt, dass insbesondere beim myelodysplastischen Syndrom (MDS), aber auch bei der AML eine Reihe von Genen des Spleißapparates mutiert sind. Diese und andere Hinweise haben verschiedene Untersuchungen zur Bedeutung der RNA-Prozessierung inklusive des Spleißens bei hämatologischen und nicht-hämatologischen Neoplasien initiiert. Im Folgenden wird die Bedeutung des Spleißens bei der AML beleuchtet.
Die Einführung der NGS-Technologie hat das Feld der Genomik revolutioniert und uns ein breites und tieferes Verständnis von Krankheiten inklusive Tumorerkrankungen auf Genomebene vermittelt (1, 2). Bei der AML haben NGS-basierte Studien wie z.B. die von Papaemmanuil und Kollegen, in der 111 tumorassoziierte Gene in 1.540 Patienten untersucht wurden, nicht nur zu einer besseren Risikostratifizierung geführt, sondern auch spezifische onkogene Treibermutationen identifiziert (3, 4). Mit Hilfe dieser Informationen können zielgerichtete Therapien entwickelt werden. Im September 2017 wurde mit Midostaurin nach Jahrzehnten das erste neue Medikament (mit Ausnahme von Gemtuzumab-Ozogamicin) bei der AML zugelassen. Midostaurin ist ein Inhibitor der FLT3-Kinase, einem Protein, das häufig bei AML-Patienten mutiert ist und mit einer schlechteren Prognose einhergeht (3, 4). Neben Midostaurin sind weitere zielgerichtete Inhibitoren gegen bekannte mutierte Proteine wie IDH1/2, BCL-2, Proteine des Hedgehog-Signaltransduktionswegs und auch weitere FLT3-Inhibitoren bereits zugelassen oder stehen kurz vor der Zulassung. Gerade auch Patienten, die aufgrund ihres Alters und von Komorbiditäten häufig keine intensive, kurative Therapie mehr bekommen können, werden von diesen neuen Medikamenten profitieren.
 
Studien haben auch gezeigt, dass überraschenderweise bei mehr als 50-60% der MDS-Patienten und bei etwa 20% der AML-Patienten Mutationen oder Genveränderungen vorkommen, die mit dem Spleißvorgang, also dem Entfernen von Introns aus der RNA, assoziiert sind (4-7). Introns sind die nicht-kodierenden Abschnitte der DNA innerhalb eines Gens, die benachbarte Exons trennen (Abb. 1A).

Unterschiede im Spleißvorgang können zu alternativen mRNA-Transkripten führen, z.B. wenn ein Exon ausgelassen wird („Exon-Skipping“, Abb. 1B). Diese alternativen mRNA-Transkripte oder Spleißvarianten können auf unterschiedlichen Wegen die Vorgänge in der Zelle steuern und verändern.

 
Abb. 1: A) Schematische Darstellung des Spleißvorgangs (mod. nach (41)). B) Verschiedene Möglichkeiten des alternativen Spleißens (mod. nach (42)).
Spleißvorgang

 
Basierend auf mRNA-Sequenzierungsstudien wird vermutet, dass physiologisch beim Menschen vermutlich etwa 60% der mRNA-Transkripte alternative Spleißtranskripte sind und bei den Multi-Exon-Genen werden sogar 90-95% alternativ gespleißt (8-10). Durch alternatives Spleißen wird die translationale Vielfalt deutlich erhöht. Alternatives Spleißen spielt in nahezu jedem biologischen Vorgang eine wichtige Rolle: bei Zellteilung und Apoptose (11), bei der embryonalen Entwicklung (12, 13), bei der zellulären Antwort auf Umweltfaktoren inklusive immunologischer Reaktionen sowie Stressreaktionen (14-16). Auch das Nervengewebe ist durch eine hohe Diversität von alternativem Spleißen gekennzeichnet (17, 18).
 
Der Spleißvorgang ist hochkomplex und Fehler in diesem System können zu aberranten, alternativen Spleißvarianten führen. Diese können z.B. als dominant-negative Regulatoren die Funktion der entsprechenden Wildtyp-Proteine inhibieren oder sie zusätzlich verstärken und so zur Kanzerogenese oder Entstehung von Leukämie beitragen (8). Verschiedene, aberrante Spleißvorgänge sind bereits mit maligner Transformation assoziiert worden (19, 20). Für einige Tumoren stellen Spleißvarianten signifikante Biomarker dar (8, 21).

Der Spleißvorgang
 
Gene werden zunächst in eine Vorläufer-mRNA (prä-mRNA) transkribiert. Diese prä-mRNA enthält neben den kodierenden Sequenzen (Exons) eingestreute, nicht-kodierende Regionen (Introns). Im Zellkern werden die Introns herausgeschnitten. Die gereifte mRNA (mature mRNA) enthält dann nur noch die aneinandergefügten Exons (Abb. 1A). Dieser Prozess wird Spleißen genannt und durch einen großen Proteinkomplex, dem Spleißosom, gesteuert. Die korrekt gespleißte mRNA wird mittels verschiedener mRNA-Bindeproteine aus dem Zellkern exportiert. Im Zytoplasma findet dann die Translation in das Protein statt (Abb. 1).
 
Das Spleißosom besteht aus über 200 verschiedenen Proteinen. Dazu gehören u.a. RNA-bindende Proteine wie „small nuclear“-Ribonukleoproteine (snRNPs, z.B. U1, U2 oder U4), hnRNPs („heterogenous nuclear“-RNP, z.B. hnRNP-A1) und Serin-Arginin-reiche Proteine (SR-Proteine, z.B. SRSF2). Grob besteht das Spleißen aus 3 Schritten: dem Erkennen der Spleißstelle am 3’- und 5’-Ende der Introns, dem Zusammenbringen dieser Spleißstelle und letztlich der katalytischen Spleißreaktion (22, 23).
 

Spleißvarianten bei der AML
 
Bei der AML sind etwa 30% der Gene im Vergleich zu CD34+ Zellen von gesunden Spendern aberrant alternativ gespleißt (24). Einige dieser Spleißvarianten finden sich gehäuft bei AML-Patienten. So gehört z.B. FLT3 zu einem der am häufigsten aberrant gespleißten Gene bei AML-Patienten. Bei etwa 50% der AML-Patienten ist das aberrant gespleißte Transkript, FLT3-Va, zu detektieren. Die Expression dieses aberranten Transkripts sinkt in der Remission (25). Dies lässt vermuten, dass FLT3-Va ähnlich wie andere Spleißvarianten möglicherweise als Biomarker dienen könnte. Allerdings fehlen hierzu detaillierte Analysen.
 
Noch häufiger als die FLT3-Spleißvariante ist bei etwa 70% der AML-Patienten ein aberrant gespleißtes Transkript von NOTCH2 zu finden (NOTCH2-Va). In-vitro-Studien deuten darauf hin, dass NOTCH2-Va als dominant-negativer Regulator des normalen („full-length“) Proteins dient. Interessant ist auch, dass eine hohe NOTCH2-Va-Expression unabhängig von anderen Markern wie FLT3-Status, zytogenetisches Risiko, Anzahl von Blasten und Alter mit einer schlechteren Prognose einhergeht (25). NOTCH2-Va ist daher nicht nur ein mögliches therapeutisches Target, sondern auch ein möglicher zusätzlicher prognostischer Marker.
 
Weitere Bespiele für aberrant gespleißte Gene sind BIRC5 (Survivin) und HOXA9. Survivin gehört zur Gruppe der Apoptose-inhibierenden Proteine. Neben dem Wildtyp-Transkript sind 4 weitere Spleißvarianten bekannt (26). Bei AML-Patienten ist die Wildtyp-Variante vorrangig exprimiert. Die deutlich selteneren Varianten Survivin2B und Survivin-ΔEx3 korrelieren allerdings mit dem Ansprechen, sodass vermutet wird, dass sie in die Leukämogenese involviert sind (27, 28). HOXA9 gehört zur Gruppe der Homeobox-Transkriptionsfaktoren. Alternatives Spleißen dieses Gens ist ein wichtiger Prozess in der normalen hämatopoetischen Entwicklung, aber auch in der myeloischen Leukämogenese (29, 30). Eine verkürzte Spleißvariante agiert hier nicht als dominant-negativer Regulator, sondern scheint das leukämische Potential des Wildtyp-Transkripts noch zu verstärken (31).
 
Gemtuzumab-Ozogamicin (GO) ist in Kombination mit Daunorubicin und Cytarabin zur Behandlung neu-diagnostizierter AML-Patienten zugelassen, deren Blasten CD33 exprimieren. Bei einigen Patienten führt der single nucleotid polymorphism (SNP) rs12459419 zu einem Austausch von Cystein durch Thymidin und dadurch zu einem Überspringen von Exon2 beim Spleißen. Dies führt zu einer verkürzten CD33-Spleißvariante (D2-CD33), der die IgV-Domäne fehlt, jene Domäne, die von GO als Epitop erkannt wird. Patienten, die diesen SNP nicht aufweisen, profitierten deutlich von der Hinzunahme von GO im Vergleich zu einer Behandlung mit Standardchemotherapie. Das SNP rs12459419 ist daher ein möglicher prädiktiver Marker für das Ansprechen auf GO (32).
 
Viele der bei der AML vorliegenden aberrant gespleißten Gene kodieren für Onkogene, Turmorsuppressorgene oder Gene, die in die Regulation von Apoptose, Zellzyklus oder Zelldifferenzierung involviert sind. Insgesamt gibt es eine deutliche und breite Dysregulation des Spleißens bei der AML (8, 24).
 

Mutationen in Genen, die in das Spleißen oder verwandte Vorgänge involviert sind
 
NGS-basierte Genom-Analysen haben gezeigt, dass mehr als 50% der Patienten mit MDS Mutationen in Genen besitzen, die am Spleißvorgang beteiligt sind (7, 33, 34). Bei der AML sind Mutationen in Genen, die beim Spleißen involviert sind, im Vergleich zum MDS deutlich seltener. Dennoch sind bei etwa 20% der AML-Patienten Gene, die für Chromatin und/oder RNA-Regulatoren kodieren, mutiert (4). Zu den am häufigsten mutierten Genen gehören u.a. SRSF2 und USAF1. SRSF2 kodiert für ein SR-Protein, das an diversen mRNA-Prozessierungsschritten beteiligt ist. Der Nachweis einer SRSF2-Mutation geht mit einer schlechteren Prognose einher (4). U2AF1 ist ein Spleißfaktor, der bei etwa 3-4% der AML-Patienten mutiert ist. Es konnten fast 400 aberrant gespleißte Transkripte mit U2AF1-Mutationen assoziiert werden (35).
 
Andere Mutationen finden sich z.B. im PRPF8-Gen. Dieses Gen kodiert für einen hoch konservierten Spleißfaktor. Im Zebrafish-Modell konnte gezeigt werden, dass mutiertes PRPF8 zu einer Differenzierungsstörung myeloischer Zellen führte, einem der wesentlichen Charakteristika akuter Leukämien (36). PRPF8-Mutationen sind ebenfalls mit einer schlechteren Prognose assoziiert (35).
 
Neben Mutationen in Spleißosom-Genen oder verwandten Faktoren gibt es auch Hinweise auf eine mutationsunabhängige Dysregulation des Spleißvorgangs. Bei MDS-Patienten und Patienten mit therapieinduzierter sekundärer AML lässt sich u.a. eine gesteigerte Expression des Wildtyp-Transkripts von SF3B1 nachweisen (37). Gleichzeitig scheint eine verminderte Expression der SR-Proteine SRSF1, SRSF3 und SRSF4 bei neu diagnostizierter AML vorzuliegen (38).
 
 
Nachlese

„Überlebenschancen von Kindern und Jugendlichen mit AML“
unter www.med4u.org/15113

„Adoptiver (T)-Zell-Transfer bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation“
unter www.med4u.org/15114

„Multiples Myelom: Die Totalremission mit sehr guter Prognose ist inzwischen möglich“
unter www.med4u.org/15115

 
Dysregulation beim Spleißen in leukämischen Stammzellen
 
Vergleichende Transkriptom-Analysen von gesunden, hämatologischen Stammzellen und leukämischen Stammzellen von MDS-Patienten und Patienten mit sekundärer AML zeigten, dass leukämische Stammzellen sekundärer AML-Patienten eine spezifische Spleißsignatur aufweisen. So ließen sich Transkripte nachweisen, die spezifisch durch TGF-b beeinflusst werden (37). Für TGF-b ist bereits bekannt, dass es über Phosphorylierung von SMAD3 die Interaktion mit dem RNA-bindenden Protein PCBP1 reguliert und damit direkt das Spleißen des Stammzellmarkers CD44 beeinflusst. In Tumorstammzellen wird dadurch bevorzugt die
mesenchymale anstelle der epithelialen Isoform exprimiert. Dies hat Auswirkungen auf die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und damit die Bildung von Metastasen bei soliden Krebszellen (39).
 
Crew et al. konnten außerdem ein vermehrtes Vorliegen von „langen“ Isoformen der BCL-2-Familie in leukämischen Stammzellen sekundärer AML-Patienten im Vergleich zu gesunden Stammzellen detektieren (37). In letzteren zeigte sich hingegen eine Dominanz proapoptotischer Isoformen. Das deutet daraufhin, dass es in leukämischen Stammzellen zu einem Wechsel des Spleißmusters zugunsten von Pro-survival-Isoformen der BCL-2-Familie kommt (37).
 
 
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