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Medizin
09. Dezember 2020

Atypische CML: ETNK-1 induzierter Mutator-Phänotyp durch Phosphoethanolamin aufhebbar/therapeutisches Potenzial

Ethanolamin-Kinase 1 (ETNK1) ist für die Phosphorylierung von Ethanolamin zu Phosphoethanolamin (P-Et) verantwortlich. Rekurrente somatische Mutationen in ETNK1 wurden bei etwa 13% der Patienten mit atypischer chronischer myeloischer Leukämie (aCML), bei 3-14% der Patienten mit chronischer myelomonozytärer Leukämie (CMML) und bei 20% der Patienten mit systemischer Mastozytose (SM) mit Eosinophilie nachgewiesen. Die Rolle der Mutationen im onkologischen Geschehen ist bisher weitgehend ungeklärt. Die Studie untersuchte dies nun mithilfe von CRISPR/Cas9- und ETNK1-Überexpressionsmodellen sowie anhand von Proben von aCML-Patienten. Hierbei konnte gezeigt werden, dass mutiertes ETNK1 zum signifikanten Anstieg der mitochondrialen Aktivität (1,87-facher Anstieg im Vergleich zu WT; p=0,0002) und der ROS-Produktion (2,55-facher Anstieg im Vergleich zu WT; p<0,0001) führt.
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Da ROS für oxidative DNA-Schäden verantwortlich sind, wurden zunächst ChIP-Seq-Daten für ETNK1-mutierte Zellen unter Verwendung eines gegen das Oxoguanin (OxoG) gerichteten Antikörpers durchgeführt. Im Rahmen der Frage, ob ETNK1-Mutationen zur Anhäufung von DNA-Läsionen führen können, wurde ein signifikanter Anstieg von OxoG in mutierten Zellen im Vergleich zu WT-Zelllinien gefunden (p=0,018). Im Anschluss daran wurde untersucht, ob diese Läsionen die Ausbildung eines Mutator-Phänotyps bewirken. Hierzu wurden 6-Thioguanin (6-TG)-Resistenz-Assays auf unsere Zellmodelle angewendet und in den mutierten Zellen ein 5,4-facher Anstieg der Kolonienzahl im Vergleich zur WT-Linie gefunden (p<0,0001). Darüber hinaus wurde analysiert, ob die ROS-vermittelte Genotoxizität bei ETNK1-mutierten Linien auch mit einer Zunahme der DNA-Doppelstrangbrüche assoziiert sein könnte. Dabei wurde eine starke Zunahme der Anzahl der γH2AX Foci (2,52-fache Zunahme; p=0,0002) bei ETNK1-N244S-Linien im Vergleich zu ETNK1-WT-Linien gefunden.

Diese Beobachtung führte zur Hypothese, dass die verminderte P-Et-Konzentration in ETNK1-mutierten Zellen für die gesteigerte mitochondriale Aktivität verantwortlich sein könnte. Unsere Experimente mit P-Et behandelten ETNK1-N244S-Zellen zeigten eine vollständige Wiederherstellung des normalen mitochondrialen Membranpotenzials und der ROS-Bildung. Darüber hinaus wurde der Mutator-Phänotyp durch die P-Et-Behandlung revertiert, was die Hypothese einer direkten Beteiligung von P-Et an der Induktion von DNA-Schäden unterstützte.

Zur Analyse des Mechanismus, durch den die intrazelluläre P-Et-Konzentration die mitochondriale Aktivität kontrollieren kann, wurden die mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungskomplexe I bis IV isoliert und die Aktivität der einzelnen Komplexe in Abwesenheit bzw. Vorhandensein steigender P-Et-Konzentrationen bestimmt. Die Analyse zeigte eine deutliche dosisabhängige Abnahme der Redox-Aktivität beim mitochondrialen Komplex II (P-Et 10 μM: 1,80-fache Abnahme; p=0,0012; P-Et 20 μM: 7,40-fache Abnahme; p<0,0001; P-Et 50 μM: 28,85-fache Abnahme; p<0,0001) und praktisch keine Wirkung bei den anderen drei Komplexen. Dies deutet darauf hin, dass P-Et das mitochondriale Potenzial durch direkte Hemmung von Komplex II kontrolliert.

Um detaillierter zu untersuchen, wie P-Et den Komplex II unterdrücken kann, wurde dessen Aktivität in Kompetitionsassays untersucht, einerseits in Anwesenheit von P-Et, andererseits bei steigenden Konzentrationen von Succinat, dem endogenen Substrat der Succinatdehydrogenase (SDH). Dabei ließ sich durch Succinat-Supplementierung ab 50 µM die normale SDH-Aktivität wiederherstellen. Die Daten deuten darauf hin, dass P-Et als kompetitiver Inhibitor von Succinat im Rahmen der SDH-Aktivität wirkt. Im Einklang hiermit zeigt das automatische Andocken von P-Et an der katalytischen Domäne von SDH, dass P-Et die Succinat-Bindungsstelle in einer energetisch günstigen Konformation besetzen kann, indem es Succinat nachahmt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die verringerte Aktivität von mutiertem ETNK1 zur Akkumulation neuer Mutationen führt, indem die Kompetition von P-Et mit Succinat verringert und die mitochondriale Aktivität sowie die ROS-Produktion gesteigert wird. Dieser Mechanismus kann, zumindest in vitro, durch P-Et-Supplementierung blockiert werden, und die durch den ETNK1-abhängigen Mutator-Phänotyp vermittelte Akkumulation von Neumutationen unterdrückt werden. Das therapeutische Potenzial von P-Et soll nun in vivo untersucht werden.

 

Quelle: ASH 2020

Literatur:

Fontana D. et al ASH 2020, LBA5

 


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