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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
20. April 2018
Seite 3/5

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Für die hämatoonkologische Diagnostik stellt der rasante Wissenszuwachs klinisch relevanter molekulargenetischer Alterationen eine große Herausforderung hinsichtlich der Entwicklung neuer qualitativer und quantitativer Analyseverfahren dar. Dabei wird die klassische, sequenzielle (Gen für Gen)-Stufendiagnostik mittels Sanger-Sequenzierung zunehmend durch moderne Hochdurchsatzsequenzierverfahren abgelöst. Diese Verfahren werden unter dem Oberbegriff NGS oder Deep Sequencing zusammengefasst und beschreiben unterschiedliche molekulargenetische Verfahren, um Sequenzanalysen von gezielten Genen (Multi-Gen-Panel Sequencing) über das gesamte Exom (Whole Exome Sequencing) bis hin zum kompletten Genom (Whole Genome Sequencing) zu bewerkstelligen. Die Einführung der NGS-Sequenzierung ermöglicht vielen medizinischen Disziplinen (Molekularpathologie, Onkologie, Humangenetik) die Analyse komplexer genetischer zum Teil krankheitsübergreifender Pathomechanismen zu entschlüsseln. Die Technologie ermöglicht dabei die parallele Analyse großer Patientenkohorten. Im Gegensatz zur konventionellen Sanger-Sequenzierung, die die Sequenzen aller DNA-Moleküle aus einer Probe zu einer Sequenz zusammenführt, werden bei der NGS-Sequenzierung die Sequenzierergebnisse von allen analysierten DNA-Molekülen einzeln abgebildet und können somit auch präziser ausgewertet werden (Abb. 2). Insbesondere für die molekulare Onkologie bietet die NGS-Sequenzierung daher den großen Vorteil, dass nun auch Mutationen mit niedrigen Allelfrequenzen (je nach zugrundeliegender Methodik: 3%-0,1% Mutationsrate) zuverlässig detektiert werden. So können mit dem Sequenziergerät MiSeq der Firma Illumina bis zu 25 Millionen Einzelsequenzen (reads) und mit dem Sequenziergerät NextSeq der Firma Illumina sogar bis zu 400 Millionen reads parallel erzeugt werden, wodurch die Sequenzierung eines kompletten humanen Genoms in nur einem Lauf ermöglicht wird.
 
Abb. 2: Sanger-Sequenzierung im Vergleich zum NGS. Ein Vorteil der NGS-Analytik gegenüber der konventionellen Sanger-Sequenzierung ist, dass durch die klonale Amplifikation der isolierten DNA eine deutlich höhere Auflösung der Ergebnisse erzielt wird. Während bei der Sanger-Sequenzierung DNA-Mischfragmente aus Wildtyp- und Tumor-DNA analysiert werden, besteht die NGS-Auswertung aus Millionen von Einzelsequenzen, die gegen ein Referenzgenom abgeglichen werden. Somit ermöglicht die NGS-Analytik den spezifischen Nachweis geringster Mengen mutierter Tumor-DNA. Bei der Sanger-Sequenzierung liegt die Nachweisgrenze hingegen bei 20% Tumor-DNA. Die Punktmutationen sind durch schwarze Pfeile markiert.
Abb. 2: Sanger-Sequenzierung im Vergleich zum NGS.


Die Sequenzierung des gesamten Genoms aus Tumorproben im Rahmen der medizinischen Grundlagenforschung bietet die Möglichkeit neue krankheitsauslösende Risiko-Gene zu identifizieren, die bspw. potenzielle Zielstrukturen für neue Medikamente darstellen. Im Gegensatz zu diesem wissenschaftlichen Ansatz ist in der molekularpathologischen Routinediagnostik die Sequenzierung des gesamten Genoms einer Tumorprobe i.d.R. nicht notwendig, da im klinischen Alltag nur auf definierte und gut charakterisierte genetische Alterationen eine stratifizierte und personalisierte Therapie aufgebaut wird. Daher kommen eher kleinere, auf kodierende Regionen beschränkte, Genpanels zum Einsatz, die weit unter 1% des gesamten Genoms ausmachen und spezifisch für die zu untersuchende Entität sind. Dieses Vorgehen hat sich nicht nur aus Sicht der Dateninterpretation, sondern auch hinsichtlich der enormen anfallenden Datenmengen als sinnvolles Vorgehen erwiesen. Als konkretes Beispiel möchten wir ein Multi-Gen-Panel (MDS/MPN-Panel) erwähnen, dass im Institut für Hämatopathologie Hamburg etabliert wurde, um Leukämien, im Speziellen myeloische Neoplasien, zu untersuchen. Dieses Multi-Gen-Panel ermöglicht eine simultane und damit kosteneffiziente Analyse von 22 diagnostisch und therapeutisch relevanten Krankheitsgenen und umfasst ein genetisches Territorium von ca. 120 Exons und 30.000 bp. Dabei können bis zu 25 Patienten (MiSeq Lauf) bzw. bis zu 130 Patienten (NextSeq, MidOutput Lauf) gleichzeitig auf Mutationen und kleine Insertionen und/oder Deletionen untersucht werden. Analysiert werden die häufigsten klonalen Marker (z.B. TET2, ASXL1, JAK2), sowie seltene klonale Marker, die nach aktueller Literaturlage stark mit dem klinischen Phänotyp der myeloischen Leukämie assoziiert sind. Ähnliche Untersuchungen wurden in publizierten Studien erfolgreich angewendet, um myeloische Neoplasien umfassend zu charakterisieren (15, 16). Um dieses genetische Territorium mittels Sanger-Sequenzierung auf Mutationen zu untersuchen, müssten ca. 40-60 Reaktionen pro Tumorprobe veranschlagt werden, was für 25 Patienten mehrere Monate Analysezeit bedeuten würde. Im Gegensatz dazu nimmt die NGS-Analytik inklusive der aufwendigen Datenanalyse nur ca. 10 Werktage in Anspruch. Zusammenfassend erlaubt die Multi-Gen-Panel-NGS-Untersuchung, Mutationen, kleine Deletionen und Insertionen (Indels) in diagnostisch oder prognostisch relevanten Zielgenen mit hoher Spezifität und Sensitivität zeitgleich zu identifizieren, um ein aussagekräftiges, patientenindividuelles Tumorprofil zu generieren. Für die Multi-Gen-Panel Untersuchung wird in der hämatologischen Routine-Diagnostik sehr häufig die Amplikon-basierte NGS-Technologie („Amplicon deep-sequencing“) verwendet. Diese ist der Sanger-Sequenzierung sehr ähnlich und ist besonders gut geeignet, um Punktmutationen und kleine Indels in bis zu 200 Genen nachzuweisen. Hierbei wird die isolierte Patienten-DNA für die Herstellung einer sog. Gen-Bibliothek („Library“) verwendet. Dazu müssen die gewünschten Zielregionen mit einer Multiplex-PCR angereichert und anschließend mit patientenspezifischen DNA-Sonden markiert werden. Im ersten Schritt werden mit hoher Spezifität alle relevanten Genabschnitte amplifiziert. Für das oben genannte MDS/MPN-Panel werden ca. 220 PCR-Reaktionen benötigt um alle kodierenden Bereiche der 22 krankheitsrelevanten Gene abzudecken. An die amplifizierte DNA werden anschließend spezifische Adapter ligiert, die dafür sorgen, dass die einzelnen PCR-Produkte (Amplikons) kovalent an einen Glasobjektträger („Flow Cell“) gebunden werden. Weiterhin werden durch die Integration von kurzen patientenspezifischen Gensonden (molekulare Barcodesequenzen) die Sequenzierprodukte bioinformatisch der jeweiligen Patienten-DNA zugeordnet. Alle Patientenproben werden anschließend vereint und auf die „Flow Cell“ geladen, auf der auch später die eigentliche Sequenzierung stattfindet. Eine zweite PCR auf der „Flow Cell“, die das gebundene markierte Amplikon als Template nutzt, sorgt für eine Vervielfältigung und führt über eine sogenannte „bridge-amplification“ zu einer Cluster-Generierung aus mehreren Hundert bis mehreren Tausend identischen Molekülen. Die anschließende Sequenzierung erfolgt zyklusweise und nutzt fluoreszenzmarkierte Nukleotide. Abschließend werden mit Hilfe von speziellen Analysesoftwares die generierten Sequenzen nach Patientenproben sortiert gegen ein Referenzgenom abgeglichen. Um technische Artefakte auszuschließen, werden nur Mutationen angezeigt, die in einer Mindestprozentanzahl von Einzelsequenzen aufgetreten sind (je nach Fragestellung 2-3%).

Die zielgerichtete Sequenzierung von Zielregionen mittels der Amplikon (PCR)-basierten NGS-Technologie stellt ein robustes und kosteneffektives System dar, um Punktmutationen und kleine Indels von vielen krankheitsrelevanten Genen simultan zu detektieren.

Ein Nachteil der Amplikon-basierten NGS-Multi-Gen-Panel-Technologie ist jedoch, dass größere genetische Alterationen ab einer Größe von ca. 600 bp wie große Indels, Genfusionen (Translokationen) oder Genamplifikationen (copy number variations, CNV) zumindest auf DNA-Ebene nicht detektiert werden können. Gerade diese großen genetischen Alterationen sind in der Hämatologie wichtig, insbesondere wenn es um die Charakterisierung und Klassifizierung von akuten myeloischen Leukämien (AML) und myeloischen Neoplasien mit Eosinophilie geht. Die große Bedeutung von Genfusionen für das Verständnis der molekularen Pathogenese der AML spiegelt sich in der aktuellen WHO-Klassifikation wieder. Das Vorliegen bestimmter balancierter Translokationen oder Inversionen ist nicht nur beweisend für das Vorliegen einer AML, sondern definiert auch den spezifischen Subtyp. Eigene Entitäten sind bspw. akute myeloische Leukämien mit RUNX1-RUNX1T1 t(8;21), PML-RARA t(15;17), MLLT3-KMT2A t(9;11) und DEK-NUP214 t(6;9)-Translokationen. Dadurch werden AML-Subtypen mit spezifischen, zytogenetischen Aberrationen getrennt von solchen, die durch ihre Myelodysplasie-assoziierten genetischen Veränderungen, therapieassoziierten Veränderung (therapieinduzierte AML) oder ihrer Morphologie (AML mit multilineärer Dysplasie oder nach FAB-Kriterien) definiert werden.
 

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