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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel

22. März 2019
Seite 2/3

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Bedeutung der Präanalytik

Für eine sichere molekularpathologische Diagnostik mittels Liquid Biopsy ist es wichtig, aus dem Patientenmaterial ausreichend cfDNA von guter Qualität zu gewinnen (5). Hierbei sind bereits die ersten Schritte der Präanalytik, also die Blutentnahme und die zeitnahe Weiterverarbeitung der Blutprobe im diagnostischen Ablauf, entscheidend.

Das Patientenblut sollte nach Entnahme mit EDTA-Röhrchen innerhalb von 2 Stunden weiterverarbeitet und die cfDNA aus dem Plasma isoliert werden. Ansonsten besteht die Gefahr, dass sich in der Blutprobe größere Mengen genomischer DNA aus zellulären Blutbestandteilen befinden, welche sowohl die Isolation der cfDNA als auch die anschließende molekularbiologische Untersuchung erschweren (5). Kann eine zügige Verarbeitung der Blutprobe nicht gewährleistet werden, stehen auf dem Markt Blutentnahmeröhrchen zur Verfügung, bei denen die zellulären Blutbestandteile durch konservierende Zusätze stabilisiert werden, sodass auch nach längeren Zeiträumen cfDNA guter Qualität gewonnen werden kann (6). Diese speziellen Entnahmeröhrchen werden meist von den Instituten mit molekularpathologischer Diagnostik zur Verfügung gestellt und sind gut für den Versand der Liquid Biopsy-Probe durch die Post geeignet. Auch bei einer Transportzeit von mehreren Tagen kann so noch ausreichend cfDNA guter Qualität für eine molekularpathologische Diagnostik gewonnen werden.

Da die Menge an cfDNA, die pro Milliliter Blutplasma isoliert werden kann, je nach Patient und Stadium der Tumorerkrankung deutlichen Schwankungen unterliegt, empfiehlt es sich, vom Patienten mind. 2 Röhrchen (bzw. 10-20 ml) Blut für eine Liquid Biopsy-Diagnostik zu entnehmen. So kann in den meisten Fällen gewährleistet werden, dass ausreichend cfDNA für diagnostische Assays zur Verfügung steht.


Techniken für die cfDNA-Analyse

Für die Mutationsdetektion auf Basis der cfDNA kommen verschiedene PCR-basierte Techniken zur Anwendung (Abb. 1) (7). Hierzu gehören die quantitative PCR (qPCR) sowie die digitale PCR, die zur gezielten Untersuchung einzelner Hotspots in bekannten Mutationscodons oder kleineren Sequenzbereichen genutzt werden können (7). Die Sensitivität, also die Detektionsgrenze für den Anteil mutierter Allele in der cfDNA, liegt für Verfahren auf Basis der qPCR bei etwa 1%. Mit Hilfe der digitalen PCR kann eine Sensitivität von 0,1% erreicht werden. Der Vorteil von Methoden auf Basis der qPCR und digitalen PCR sind die im Verhältnis zum Next Generation Sequencing (NGS) geringeren Kosten sowie eine kurze Probenlaufzeit bis zur Diagnose. Der Nachteil ist, dass die cfDNA nur auf bereits bekannte, tumorassoziierte Mutationen getestet werden kann. Verfahren auf Basis des NGS bieten zusätzlich die Möglichkeit, bisher für den spezifischen Tumor des Patienten auch unbekannte, aber möglicherweise therapierelevante tumorassoziierte Mutationen zu identifizieren. Die Sensitivität des NGS liegt derzeit bei 0,1% mutierter Allele in der cfDNA. Die Technik bietet das Potential, die analytische Empfindlichkeit weiter zu erhöhen. Dies führt aber unvermeidlich zu einer Kostensteigerung.


Liquid Biopsy in der molekularpathologischen Diagnostik


Therapie des NSCLC

Patienten mit NSCLC profitieren im Rahmen zielgerichteter Krebstherapien beim Nachweis spezifischer aktivierender EGFR (epidermal growth factor receptor)-Mutationen von einer EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)-Therapie (8). Mit einem Anteil von 85% sind Deletionen oder Insertionen in Exon 19 oder die Punktmutation L858R in Exon 21 die häufigsten primären EGFR-Mutationen (8). Unter Therapie mit EGFR-TKI der ersten und zweiten Generation wie Erlotinib und Afatinib entstehen bei rund 50% der Patienten Resistenzmutationen gegen den Wirkstoff, am häufigsten die Punktmutation T790M in Exon 20 des EGFR-Gens. Diese Patienten können bei nachgewiesener Resistenzmutation von einer Therapie mit einem EGFR-TKI der dritten Generation wie Osimertinib profitieren (8).

Der Nachweis dieser Mutationen für die Indikation einer EGFR-TKI-Therapie kann gemäß der S3-Leitlinie (9), sofern nicht ausreichend Gewebe für eine molekularpathologische Diagnostik vorhanden ist, das Ergebnis der Gewebebiopsie negativ bezüglich des Nachweises einer EGFR-T790M-Mutation ausfällt oder eine Gewebe-Rebiopsie nicht möglich ist, auch mittels einer Liquid Biopsy-Diagnostik an cfDNA erbracht werden.

Zu erwähnen ist, dass eine Resistenz gegen eine EGFR-TKI-Therapie auch über einen Shift des histologischen Tumorsubtyps zu einem kleinzelligen neuroendokrinen Karzinom hervorgerufen werden kann (10). Dieser Resistenzmechanismus ist nur über die histologische Untersuchung einer FFPE-Gewebeprobe nachweisbar (8, 10).


EGFR-Mutationsdiagnostik

Für die molekularpathologische Diagnostik therapierelevanter EGFR-Mutationen auf Basis von cfDNA gibt es zum aktuellen Zeitpunkt kein Standardverfahren. Auf Basis der qPCR sind auf dem Markt verschiedene Tests mit CE-IVD-Zertifizierung verfügbar. Mit dem „cobas® EGFR Mutation Test v2“ (11) kann die cfDNA aus Plasma im Rahmen einer Liquid Biopsy auf 42 relevante Mutationen in Exon 18, 19, 20 und 21 des EGFR-Gens untersucht werden. Der „therascreen® EGFR Plasma RGQ PCR Kit“ (12) deckt mit Deletionen in Exon 19 sowie den Punktmutationen T790M und L858R nur ein eingeschränktes Spektrum an EGFR-Mutationen ab. Der „QClamp® EGFR Mutation Detection Test“ (13) umfasst Mutationen in Exon 18, 19, 20 und 21 von EGFR.

In der Literatur wurden jedoch bereits verschiedene Resistenzmutationen gegen EGFR-TKI der dritten Generation, wie die Punktmutation EGFR-C797S, beschrieben (8). Solche seltenen, neu identifizierten, aber therapeutisch relevanten Mutationen können nicht mit bereits kommerziell verfügbaren qPCR-Assays diagnostiziert werden.

Für die molekularpathologische Diagnostik solcher bisher unbekannten, aber therapierelevanten Mutationen können NGS-basierte Verfahren verwendet werden. Hierfür sind auf dem Markt kommerziell verfügbare NGS-Panels wie der Oncomine™ Lung cfDNA Assay, der AVENIO ctDNA Analysis Kit oder die QIASeq™ Targeted DNA Panels erhältlich.

Mit Hilfe solcher NGS-Panels können neben EGFR-Mutationen auch Mutationen in weiteren mit der Tumorgenese und Progression assoziierten Genen identifiziert werden. Beim NSCLC zählen hierzu therapierelevante Mutationen von ALK (anaplastic large cell lymphoma receptor tyrosine kinase), BRAF (B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase), PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) oder auch resistenzvermittelnde Mutationen in z.B. KRAS (KRAS proto-oncogene, GTPase).

 

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