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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel

10. September 2010 Diagnostischer Algorithmus zur HER2-Bestimmung im fortgeschrittenen Magenkarzinom

Philipp Ahrens, HH Kreipe, Florian Länger, Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover.

Analog zu Mammakarzinomen werden seit kurzem auch metastasierte Magenkarzinome und Adenokarzinome der gastroösophagealen Junktionszone mit Überexpression des EGFR2-Rezeptors (synonym HER2) mit dem humanisierten Antikörper Trastuzumab (Herceptin®) behandelt. Der EGFR2-Rezeptor (HER2) stellt einen transmembranösen Rezeptor dar, der nach Bindung mit Agonisten Homo- oder Heterodimere mit Rezeptormolekülen der EGFR-Familie formt und eine intrazelluläre Signalkaskade mit Vermittlung einer Wachstumsbeschleunigung anstößt. Die Zulassung von Trastuzumab zur Behandlung des Magenkarzinoms durch das European Board (EMEA) erfolgte auf dem Boden der Ergebnisse der randomisierten und kontrollierten Phase-III-Studie zur Wirksamkeit von Trastuzumab beim fortgeschrittenen Magenkarzinom (ToGA). Dabei wurde in 22,1% von insgesamt 3807 fortgeschrittenen Magenkarzinomen eine HER2-Überexpression nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass sich bei den 584 chemotherapeutisch behandelten Patienten (Cisplatin und 5-Fluorouracil/Capecitabin mit oder ohne kombinierte Gabe von Trastuzumab) die mediane Überlebenszeit bei Kombination von Trastuzumab und klassischer Chemotherapie um 2,4 Monate verlängerte. In der Subgruppe der Patienten mit gesicherter HER2-Überexpression konnte sogar eine Verlängerung des medianen Überlebens um 4,2 Monate von durchschnittlich 11,8 auf 16 Monate nachgewiesen werden [1, 7]. Die Indikation zur Chemotherapie mit Trastuzumab ist deshalb vom Nachweis einer Überexpression von HER2 abhängig. Vor diesem Hintergrund ist eine reproduzierbare und qualitätsgesicherte Bestimmung der HER2-Expression beim Magenkarzinom in Analogie zum Mammakarzinom notwendig. Diese Übersicht beschreibt die Techniken der immunhistochemischen und molekularzytogenetischen (FISH) Analyse der HER2-Expression und den Testalgorithmus beim Magenkarzinom.
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Materialvoraussetzung des Testgewebes/ Fixation

Geeignet sind prinzipiell alle bioptisch gewonnenen Gewebeproben bzw. auch Operationspräparate. Zum optimalen Antigenerhalt muss die Fixation der Proben umgehend in gepuffertem Formalin (4%) erfolgen. Diese Fixation sollte mindestens 6 Stunden zur optimalen Gewebedurchdringung und maximal 48 Stunden zur Vermeidung zu großer Aldehydgruppenvernetzungen innerhalb des Gewebes erfolgen. Nach Einbringen des Gewebes in einen Paraffinblock in typischer Weise ist das Gewebe langfristig archivierbar, d. h. auch nach Jahren können Bestimmungen nachträglich veranlasst werden.

Zahl der Biopsien

Es gibt bislang keine Vergleichsstudien bzgl. der notwendigen Biopsiezahl für eine möglichst repräsentative Aussage. Es gilt die allgemeine Leitlinienempfehlung, aus tumorverdächtigen Läsionen 6-8 Proben zu entnehmen.

Auswahl des Tumorgewebes für die Testung

Areale mit intestinaler Differenzierung zeigen mit höherer Wahrscheinlichkeit eine HER2-Expression, dies sollte bei der Auswahl der Areale für die Testung von mischdifferenzierten Tumoren berücksichtigt werden [5]. Bezüglich der Korrelation der Expression von HER2 zwischen Primärtumor und Metastase liegen bislang nur wenige Daten vor, die jedoch auf eine gute Vergleichbarkeit hindeuten. Deshalb erscheint eine Testung an Biopsien von Metastasen möglich und sinnvoll.

Immunhistochemische Bestimmung der HER2-Expression

Grundlage der HER2-Bestimmung beim Magenkarzinom ist zunächst eine konventionelle immunhistochemische Untersuchung. Immunhistochemische Verfahren nutzen Farbstoff-gekoppelte Antikörper zum Proteinnachweis im Schnittpräparat und stellen das primäre Testverfahren zur Bestimmung des HER2-Status im Magenkarzinom dar. Bei Übereinstimmung des technischen Ablaufs der Färbung mit dem Vorgehen beim Mammakarzinom ergeben sich für die Auswertung jedoch Abweichungen.

Der Testablauf gliedert sich in folgende Phasen:
- Bestätigung des Vorliegens eines Karzinoms im vorliegenden Blockmaterial anhand einer konventionellen Färbung (HE)
- Durchführen der immunhistochemischen Färbung unter Einsatz des HER2-Antikörpers
- Auswertung der Immunreaktion anhand des modifizierten ToGA-Protokolls bei Nachweis einer fraglich positiven Immunreaktion (2+, s.u.) Durchführen einer ergänzenden FISH-Untersuchung.

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Abb. 1: Diagnostischer Algorithmus zur HER2-Bestimmung im Magenkarzinom

Leitlinien zur Auswertung der Immunhistochemie

Das zur immunhistochemischen Bestimmung der HER2-Expression im Magenkarzinom empfohlene Scoring-System unterscheidet sich in wichtigen Punkten von den etablierten ASCO/CAP Richtlinien, welche standardisiert in der Mammadiagnostik Anwendung finden [8]. Während in der Mehrzahl der Mammakarzinome eine homogene Verteilung der HER2-Expression vorliegt, zeigen ca. 25% der fortgeschrittenen Magenkarzinome eine heterogene oder herdförmige HER2-Expression und/oder Amplifikation innerhalb des Tumors (Abb. 2e). Deshalb musste der Auswertealgorithmus entsprechend angepasst werden.

Analog zu den ASCO/CAP Empfehlungen zur HER2-Testung im Mammakarzinom, kommt bei der Auswertung der HER2-Immunhistochemie im Magenkarzinom ein dreigliedriges Scoring-System zur Anwendung [3, 4, 5, 8]. Da die HER2-Rezeptoren in den Magenkarzinomzellen in der Regel in der basalen und basolateralen, nicht aber in der luminalen Zellmembran lokalisiert sind, werden sowohl Zellen mit inkompletter als auch zirkulärer Membranfärbung ausgewertet:

1. Score 0+ oder 1+ = keine Überexpression (Abb. 2b): keine oder lediglich schwache Membranfärbung basal/basolateral oder zirkulär
2. Score 2+ = grenzwertige Überexpression (Abb. 2c), Abklärung durch FISH: mäßige Membranfärbung basal/basolateral oder zirkulär
3. Score 3+ = kräftige Überexpression (Abb. 2d): starke Membranfärbung basal/basolateral oder zirkulär.

Die Färbeintensität spielt eine wichtige Rolle für die korrekte Beurteilung des HER2-Färbeergebnisses, sie kann anhand der zum Erkennen der Färbereaktion notwendigen Vergrößerung am Mikroskop abgeschätzt werden. Eine starke HER2-Überexpression (Score 3+) lässt sich bereits in der Lupenvergrößerung (20-40x Vergrößerung) gut erkennen. Wenn die Membranfärbung erst in 100-facher Vergrößerung sichtbar wird, ist dagegen ein Score von 2+ zu vergeben. Bei Nachweis der Färbung erst in noch höherer Vergrößerung (>400x Vergrößerung) liegt lediglich ein Score von 1+ vor [5].

Der globale Grenzwert von mindestens 10% positiven Tumorzellen musste zumindest für die Beurteilung von Biopsien abgeschafft werden. Um durch die Heterogenität der Expression bedingte falsch negative Ergebnisse in der Biopsie zu vermeiden, werden nicht 10% positive Tumorzellen, sondern 5 im Verband gelegene und positiv gefärbte Tumorzellen als untere Nachweisgrenze definiert [5, 6].

Immunhistochemische Bestimmung der HER2-Expression

Übersicht der Ergebnisse der HER2-Expression beim Magenkarzinom

Eine HER2-Überexpression ist definiert als immunhistochemische 3+ oder als 2+ Expression mit Nachweis einer Amplifikation in der FISH-Untersuchung (s.u.). Insgesamt waren in der ToGA-Studie ein Score von 2+ in 12% und ein Score von 3+ in 11% der Karzinome darzustellen. Diese HER2-Expression findet sich überwiegend in den intestinal (d. h. drüsig) differenzierten Abschnitten, 30% der derartig differenzierten Magenkarzinome zeigen eine HER2-Überexpression. Dagegen sind Magenkarzinome vom diffusen Typ nur selten positiv (<5%), reine Siegelringzellkarzinome praktisch immer negativ. Bei Karzinomen mit intestinaler und diffuser Mischdifferenzierung lässt sich eine HER2-Positivität in ca. 15% der drüsig differenzierten Anteile nachweisen (Abb. 2e).

Fallstricke der immunhistochemischen HER2-Testung

Die Anwendung der von der Diagnostik beim Mammakarzinom „gewohnten“ Kriterien führt für das Magenkarzinom zu einer hohen Rate an falsch negativen Befunden. Dies liegt in der Heterogenität der Expression und inkompletten Membranfärbung beim Magenkarzinom begründet. Nur bei Beachtung der o.g. Auswertekriterien kann dies vermieden werden. Auch die Gefahr einer falsch positiven Beurteilung besteht prinzipiell, es sollten deshalb nur validierte Assays zum Einsatz kommen (HercepTest, DAKO u. 4B5, Ventana).

Molekularzytogenetische HER2-Bestimmung mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Im Gegensatz zur HER2-Diagnostik im Mammakarzinom, bei der die immunhistochemische und molekularzytogenetische Testung gleichwertige Verfahren darstellen, ist beim Magenkarzinom die Immunhistochemie das primäre Testverfahren zur HER2-Bestimmung. Die Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) dient hier ausschließlich der weiterführenden Abklärung eines immunhistochemisch als 2+ klassifizierten Tumors.

Zur Anwendung in der FISH-Analyse kommen Sondenpaare, welche zum einen den spezifischen Genlocus 17q12 (HER2/neu), zum anderen die Zentromer-Region des Chromosoms 17 (Kontrollsignal) markieren. Bei optimaler Schnittdicke von 5 µm erfolgen Vorbehandlung und Hybridisierung gemäß standardisierter Protokolle. Zur Auswertung werden mindestens 20 kohäsive Tumorzellen ausgezählt und die Anzahl der locusspezifischen Signale für 17q12 (HER2/neu) zur Anzahl der Kontrollsignale (Centromer 17) in Relation gesetzt. Folgende Signalkonstellationen können hierbei auftreten:

1. Normale Signalverteilung mit je 2 Signalen für HER2 und das Kontrollsignal und einer Ratio von ca. 1,0.
2. Polysomie, aber keine Genamplifikation bei mehr als 2 Signalen für HER2 und das Kontrollsignal, oder das Kontrollsignal allein, bei einer Ratio von < 2,0.
3. Sichere HER2-Genamplifikation mit einer Ratio ≥ 2,0 mit oder ohne Polysomie (Abb. 2f).

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Abb. 2:
a) Mäßig differenziertes Magenkarzinom vom intestinalen Typ mit drüsiger Architektur (HE);
b) HER2-Immunhistochemie: Score 1+, schwache zirkuläre Membranfärbung im drüsig differenzierten Karzinom;
c) HER2-Immunhistochemie: Score 2+, mäßig starke zirkuläre Membranfärbung im drüsig differenzierten Karzinom;
d) HER2-Immunhistochemie: Score 3+, starke zirkuläre Membranfärbung im drüsig differenzierten Karzinom;
e) Magenkarzinom mit Mischdifferenzierung: der drüsig (intestinal) differenzierte Anteil zeigt einen HER2-Score 2+ (Bildhälfte oben und links). Der diffuse, teils siegelringzellige Anteil weist einen HER2-Score von 0+ auf (rechter unterer Bildanteil);
f) HER2-Genamplifikation (FISH), dargestellt durch grün fluoreszierende Signalcluster.

Fallstricke der zytogenetischen HER2 Testung

Da insbesondere fortgeschrittene Magenkarzinome häufig eine Mischdifferenzierung aufweisen, ist ein sorgfältiges Durchmustern des gesamten Schnittpräparates unabdingbar, um kleine amplifizierte Tumorfoci nicht zu übersehen. Ebenso muss sichergestellt sein, dass kleine, immunhistochemisch grenzwertig HER2-überexprimierende Tumorareale (2+) im FISH Präparat mit erfasst sind.

Bislang gibt es keine klaren Richtlinien dazu, wie mit Karzinomen verfahren werden soll, welche keine sichere Genamplifikation (Ratio < 2,0), wohl aber eine Polysomie aufweisen. In diesen Fällen ist letztlich das Ergebnis der immunhistochemischen Untersuchung für die Therapieentscheidung relevant, wonach nur Fälle mit einem Score von 3+ für eine Therapie mit Trastuzumab in Frage kommen.

Fazit

Zusammenfassend liegt gemäß der Ergebnisse der ToGA-Studie zur Wirksamkeit von Trastuzumab (Herceptin®) im fortgeschrittenen/metastasierten Magenkarzinom eine Indikation zur Herceptin®-Therapie vor, wenn primär immunhistochemisch eine gesicherte HER2-Überexpression (Score 3+) vorliegt, bzw. in grenzwertig überexprimierenden Fällen (Score 2+) eine Genamplifikation (Ratio > 2,0) in der FISH-Untersuchung nachgewiesen wurde.

Hierbei gilt die Immunhistochemie als das primäre Testverfahren zur HER2-Bestimmung, anders als beim Mammakarzinom, wo Immunhistochemie und FISH als gleichwertige Verfahren etabliert sind.

Um dem speziellen Verteilungsmuster der HER2-Rezeptoren in der Zellmembran der Magenkarzinomzellen und der teils ausgeprägten Tumorheterogenität bzw. Mischdifferenzierung in fortgeschrittenen Magenkarzinomen Rechnung zu tragen, wurden die etablierten ASCO/CAP-Auswerterichtlinien entsprechend modifiziert.

Auf der Basis der ToGA-Ergebnisse wird sich die immunhistochemische und molekularzytogenetische HER2-Bestimmung als fester Bestandteil der pathologisch-anatomischen Routinediagnostik des Magenkarzinoms etablieren, damit möglichst alle Patientinnen und Patienten mit fortgeschrittenem, HER2-positivem Karzinom von einer Trastuzumab-Therapie profitieren können.
Um einheitliche Qualitätsstandards in der HER2-Testung, sowohl auf der Seite der technischen Durchführung, als auch der Auswertung zu gewährleisten, bietet die Qualitätssicherungs-Initiative der Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Berufsverbandes Deutscher Pathologen zur diagnostischen Immunhistochemie und Molekularpathologie (QuIP) allen histopathologischen Einrichtungen die Teilnahme an Ringversuchen an.

(http://www.dgp-berlin.de/index.php/ringversuche/uebersicht-laufende-ringversuche/her2-rezeptor-beim-magenkarzinom-2010).


Literatur

1. Bang Y, Chung H, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O, Al-Sakaff N, See C, Rüschoff J, Van Cutsem E. Pathological features of advanced gastric cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. JCO;27:15s:(ASCO 2009, Abstr. No 4556).
2. Barros-Silva JD, Leitão D, Afonso L, Vieira J, Dinis-Ribeiro M, Fragoso M, Bento MJ, Santos L, Ferreira P, Rêgo S, Brandão C, Carneiro F, Lopes C, Schmitt F, Teixeira MR. Association of ERBB2 gene status with histopathological parameters and disease-specific survival in gastric carcinoma patients. Br J Cancer (2009);100:487-93.
3. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, Ochiai A, Rüschoff J, Henkel T (2008) Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology;52:797-805.
4. Rüschoff J et al. (2010) Her2 testing in gastric cancer: Guideline validation and development. Virch Arch, 2010 Jul 28 (Epub ahead of print)
5. Rüschoff J, Nagelmeier L, Baretton G, Dietel M, Höfler H, Schildhaus H, Büttner R, Schlake W, Stoss O, Kreipe H (2010) Her2-Diagnostik beim Magenkarzinom – Was ist anders im Vergleich zum Mammakarzinom? Pathologe;31:208-217.
6. Tapia C, Glatz K, Novotny H, Lugli A, Horcic M, Seemayer CA, Tornillo L, Terracciano L, Spichtin H, Mirlacher M, Simon R, Sauter G (2007) Close association between HER-2 amplification and overexpression in human tumors of non-breast origin. Mod Pathol;20:192-8.
7. Van Cutsem E, Kang Y, Chung H, Shen L, Sawaki A, Lordick F, Hill J, Lehle M, Feyereislova A, Bang Y (2009) Efficacy results from ToGA trial: A phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy (CT) in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer (GC). JCO;27:18s:(ASCO 2009, Abstr. No 4509).
8. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, Dowsett M, Fitzgibbons PL, Hanna WM, Langer A, McShane LM, Paik S, Pegram MD, Perez EA, Press MF, Rhodes A, Sturgeon C, Taube SE, Tubbs R, Vance GH, van de Vijver M, Wheeler TM, Hayes DF; American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists (2007) American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol;25:118-145.


Abstract

Philipp Ahrens, Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover;

The humanized antibody trastuzumab (Herceptin) recently has been introduced into the protocol for firstline treatment of advanced, metastatic carcinoma and adeno-carcinoma of the gastroesophageal junction. Results of the randomized, controlled phase III trial of the efficacy of trastuzumab in advanced gastric cancer (ToGA) were the basis for approval by the European Board (EMEA). During the ToGA trial, 584 participatory patients with locally advanced or metastatic gastric cancer received either conventional chemotheraphy with cisplatin and 5-fluorouracil/capecitabine, or they received conventional chemotheraphy with combined application of trastuzumab (Herceptin).

It was shown that the combination of trastuzumab and conventional chemotherapy increased the median overall survival by 2.4 months. An even better prolongation of the median overall survival could be demonstrated in a subgroup of patients with confirmed HER2 overexpression, where the overall survival rose to 4.2 months (11.8 to 16 months).

A HER2 overexpression of the tumor, as detected by the pathologist, is the prerequisite for the use of trastuzumab in breast cancer. Due to the different membranous staining pattern and the widespread heterogenity of HER2 expression, modifications of the standardized immunohistochemical scoring criteria (ASCO/CAP) as used for breast cancer must be applied to evaluate the HER2 status of gastric carcinomas. This review discusses the technical standards and algorithm of HER2 analysis in stomach cancer.

Keywords: advanced metastatic carcinoma, adeno-carcinoma of the gastroesophageal junction, trastuzumab, HER2 overexpression, immunohistochemical scoring criteria, algorithm


Dr. Phillip Ahrens

Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Carl-Neuberg-Straße 1
30629 Hannover

Tel.: 0511 / 532 4501
Fax: 0511 / 532 5799

Email: Ahrens.Philipp@mh-hannover.de

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