26. April 2017

Resistenzmechanismen in der zielgerichteten Therapie des Malignen Melanoms

T. Sinnberg, T. Amaral, Universitätshautklinik Tübingen.

Ausgabe 03 / 2017
Als der spezifische BRAF-V600E-Inhibitor Vemurafenib im Jahr 2012 für das metastasierte Melanom zugelassen wurde, begann ein Paradigmenwechsel in der Melanomtherapie, der sich bis heute fortsetzt. Weitere Meilensteine waren die Einführungen der BRAF/MEK-Kombinationstherapien Dabrafenib plus Trametinib und Vemurafenib plus Cobimetinib, sowie der Checkpoint-Inhibitoren als neue Form der Immuntherapie. Diese Fortschritte verbesserten das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben von Stadium-IV-Melanompatienten dramatisch. Trotzdem kommt es bei einer nicht unerheblichen Zahl von Patienten unter den zielgerichteten Therapien zum Progress oder bereits initial zum Therapieversagen. Daher sind sowohl Kenntnis der Resistenzmechanismen als auch mögliche Strategien zur Überwindung dieser Mechanismen von hoher Bedeutung und könnten die Richtung für neue zielgerichtete Kombinationstherapien weisen.
Neben den Immuntherapien mit den Checkpoint-Inhibitoren ist die Therapie mit BRAF- und MEK-Inhibitoren beim metastasierten Melanom mit BRAFV600-Mutation der Goldstandard. Dennoch sprechen bis zu 30% der Patienten trotz vorhandener BRAF-Mutation schlecht oder gar nicht auf die Therapie an. Manche Tumorzellen scheinen sich adaptieren zu können, so dass sie trotz zielgerichteter Inhibition des MAPK-Signalwegs überleben. In einigen dieser unter Therapie persistierenden Melanomzellen kann es innerhalb von Monaten zur Entstehung von Resistenzen und damit zu Rezidiven mit erneutem Progress kommen. Die Mechanismen, welche zu einem Therapieversagen von BRAF-Inhibitoren (BRAFi) und deren Kombination mit MEK-Inhibitoren (BRAFi/MEKi) führen, sollen im Folgenden unter Berücksichtigung der zeitlichen Dreiteilung 1. primär/intrinsisch, 2. adaptiv und 3. sekundär/erworben vorgestellt werden (Abb. 1). Manche der Mechanismen sind dabei in mehreren Phasen relevant. Insbesondere die Grenzen von erworbener und adaptiver Resistenz müssen als fließend angesehen werden.
 
Abb. 1: Phasen und Hauptfaktoren der Resistenzentwicklung gegen die Blockade des MAPK-Signalwegs mittels BRAF/MEK-Inhibitoren. Mut.=Mutationen; SNV=Einzelnukleotidvarianten; Amp.=Amplifikation; Del.=Deletion; Exp+=erhöhte Expression; Exp-=erniedrigte Expression
Abb. 1: Phasen und Hauptfaktoren der Resistenzentwicklung gegen die Blockade des MAPK-Signalwegs mittels BRAF/MEK-Inhibitoren.



Intrinsische oder primäre Resistenzmechanismen

Eine primäre oder intrinsische Resistenz gegen BRAFi/MEKi zeigt sich klinisch darin, dass eine messbare Therapieantwort ausbleibt. Für Patienten mit primärer Resistenz bringt die Therapie mit BRAFi/MEKi trotz vorhandener BRAF-Mutation keinen Nutzen. Diese Patienten sollten möglichst rasch Zugang zu Alternativtherapien, wie den Checkpoint-Inhibitoren (anti-PD-1 oder anti-PD-1/anti-CTLA-4), erhalten. Zukünftig könnten zusätzlich kombinierte, zielgerichtete Therapeutika zur Überwindung der Resistenz eingesetzt werden. Im Folgenden werden wir auf einige, die Antwort auf BRAFi/MEKi limitierende, intrinsische Resistenzmechanismen eingehen.

 

Freisetzung von Wachstumsfaktoren

Das Mikromilieu eines Tumors trägt wesentlich zum Ansprechen der Tumorzellen auf Therapeutika bei. Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) ist der Ligand der Rezeptor-Tyrosinkinase MET, welche auf vielen Tumorzellen exprimiert wird. Wird diese über Ligandenbindung aktiviert, unterstützen die intrazellulären Signalwege zelluläre Prozesse wie Proliferation, Zellüberleben, Zellmigration und -invasion sowie epithelial-mesenchymale Transition (EMT) (1-3). HGF wurde mehrfach als Resis-tenz-vermittelnder Faktor gegen BRAFi identifiziert (4, 5). Dabei aktiviert das von Stromazellen sezernierte HGF den MET-Rezeptor auf Melanomzellen, was zu einer Aktivierung des MAPK- und PI3K-Signaltransduktionswegs in den Tumorzellen führt. Eine derartige HGF-Sezernierung durch Stromazellen wurde vermehrt in Melanom-metastasen mit primärer Resistenz gegen BRAFi entdeckt (4). Melanome unter BRAFi-progredienten Patienten wiesen dabei teilweise genomische Amplifikationen von MET auf. In patient-derived Xenograft-Mausmodellen waren diese Tumore anfällig für eine kombinierte BRAF/MEK/MET-Triple-Therapie (6). Weitere Wachstumsfaktoren wie IGF1, EGF, FGF oder NRG1 konnten in vitro eine Resis-tenz gegen BRAFi induzieren (5), deren klinische Bedeutung im Patienten ist jedoch relativ unklar.


Hyperaktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen

Da unterschiedliche Liganden in der Lage sind, eine Resistenz gegen BRAFi zu vermitteln, scheint es naheliegend, dass eine übermäßige Aktivierung der korrespondierenden Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) ebenfalls zur Resistenz führt. Der IGF-1-Rezeptor (IGF1R) besteht aus zwei Liganden-bindenden α-Untereinheiten und zwei β-Untereinheiten. Bindet IGF-1, führt dies nach erfolgter Autophosphorylierung schließlich zur Aktivierung der Signalwege MAPK und PI3K (7, 8). Eine durch IGF1R vermittelte Resistenz kann experimentell mit Inhibitoren wie Cyclolignan picropodophyllin (PPP) erfolgreich überwunden werden (9, 10).


COT-Überexpression

Eine erhöhte Expression von MAP3K8 oder COT wurde von Johannessen et al. in Melanomzellen als ursächlich für ein Nicht-Ansprechen auf BRAFi identifiziert (11). COT bedingt dabei eine RAF-unabhängige Aktivierung von MEK/ERK. Auch in Biopsien mit erworbener Resistenz gegen BRAFi/MEKi konnte dieser Mechanismus der alternativen MAPK-Aktivierung über COT gefunden werden. Andere Pub-likationen bestätigten den Zusammenhang zwischen einer erhöhten COT-Expression und der Resistenz gegen BRAFi sowie die BRAFi/MEKi-Kombination (12). In patient-derived Xenograft-Melanommodellen waren Resistenzen gegen die Inhibition des MAPK-Signalwegs ebenfalls mit COT assoziiert (13).


Verlust von Neurofibromatosis 1

Neurofibromatosis 1 (NF1) ist ein Tumorsuppressor, der RAS inhibiert und damit u.a. das Wachstum von Fibrosarkomen inhibiert. Ein Verlust von NF1 führt über ein verstärktes RAS-Signalling zur MAPK-Signalwegsaktivierung und folglich zur Resistenz gegen BRAFi (14-17).


Mutationen in RAC1

Das Genprodukt von RAC1 (Ras-related C3 Botulinumtoxin-Substrat 1) gehört als kleines G-Protein zur Familie der Rho-GTPasen. Es ist besonders an der Organisation des Zytoskeletts beteiligt und als solches wichtig bei Adhäsion, Migration und Invasion von Tumorzellen (18, 19). Beim Melanom konnten in bis zu 5% der untersuchten Tumore Mutationen in RAC1 identifiziert werden (20, 21). In Melanomen mit hoher UV-Exposition scheinen RAC1-Mutationen nach BRAF- und NRAS-Mutationen an dritter Stelle zu stehen (22). Dabei aktiviert die Mutation P29S konstitutiv RAC1 und führt neben der Resistenz gegen BRAFi/MEKi zu erhöhtem Zellüberleben, gesteigerter Zellteilungsrate und erhöhter Motilität. RAC-Inhibitoren zur Überwindung einer durch RAC1-vermittelten Resistenz sind bis dato in präklinischer Entwicklung.


Veränderungen und Aberrationen von PTEN

Das Phosphatase und Tensin homologe Protein (PTEN) wirkt negativ regulatorisch auf den PI3K/AKT-Signalweg und reduziert dabei die Phosphorylierung von AKT. Ein Verlust der PTEN-Aktivität kann über eine vermehrte AKT-Aktivierung zur Resistenz gegen BRAFi führen. Dies wurde vor allem in Zellkulturmodellen gezeigt (23). Dabei korrelierte die PTEN-Expression mit der durch BRAFi-induzierten Apoptose. Das konnte durch eine verminderte Induktion des pro-apoptotischen Bcl-2-Proteins Bim in PTEN-defizienten Melanomzellen erklärt werden (24). Treten inaktivierende PTEN-Mutationen zusammen mit einem RB1-Funktionsverlust auf, so führte dies ebenfalls zur Resistenz gegen BRAFi sowie MEKi. Derartige Melanomzellen sind weniger abhängig vom MAPK-Signalweg (25). Weiter zeigten sich Zelllinien mit Verlust von PTEN und Notch1-Aktivierung resistent gegenüber einer Inhibition des MAPK-Signalwegs durch beispielsweise ERK-Blockade. Diese Resistenz konnte mittels eines γ-Sekretase-Inhibitors aufgehoben werden (26). Klinisch korrelieren Aberrationen in PTEN mit einem schlechteren progressionsfreien Überleben (PFS) unter Dabrafenib. So lag das PFS ohne PTEN-Veränderungen bei 32 Wochen, wohingegen es mit PTEN-Aberration nur 18 Wochen betrug (27, 28).

 

Cyclin- und CDK-abhängige Resistenzmechanismen

CDKN2A ist ein Tumorsuppressorgen, welches über INK4A/ARF einen Zellzyklusarrest und Seneszenz induzieren kann. Mutationen im CDKN2A-Tumorsuppressorgen können zum Funktionsverlust von p16 führen. Damit geht die negative Regulation der CDK4 und die damit verbundene Zellzykluskontrolle verloren, was zur permanenten Tumorzellproliferation führen kann. CDKN2A-Mutationen verschlechterten das 3-Jahres-Gesamtüberleben von Patienten unter BRAFi/MEKi-Kombinationstherapie deutlich (24% versus 55%) (29). Physiologisch bindet CyclinD1 an CDK4 und 6 und aktiviert diese. Daher führen der Verlust (neben Mutationen durch Kopien-zahländerungen hervorgerufen) von p16, eine Amplifikation von CyclinD1 (27) oder aktivierende Mutationen von CDK4 unabhängig vom MAPK-Signalweg zur unkontrollierten Zellteilung. Damit stellen diese Aberrationen weitere intrinsische Veränderungen dar, die zur Resistenz gegen BRAFi führen (30).


HOXD8-Mutation

HOXD8 ist ein Homöobox-Transkriptionsfaktor, der bei verschiedenen Tumor-erkrankungen eine Rolle spielt. In einer Patientenprobe mit sehr früher Resis-tenzentwicklung gegen BRAFi konnte eine non-sense Mutation in HOXD8 als einziger Mechanismus ausfindig gemacht werden (31).


Kreuzresistenz gegen MEK- und PI3K-Inhibition

Häufig erweisen sich Melanomzellen mit primärer Resistenz gegen BRAFi als ausgesprochen kreuzresistent gegen MEKi, PI3Ki oder mTORi (32). Dennoch scheinen in solchen Fällen Kombinationstherapien aus MEKi plus PI3Ki oder mTORi aussichtsreich zu sein. Weitere präklinische und klinische Studien werden hier künftig hoffentlich Klarheit bringen.


Erworbene oder sekundäre Resistenzmechanismen

Sprechen Tumore zunächst auf eine Therapie bis zum Therapieversagen an, spricht man von erworbener oder sekundärer Resistenz. Unter dem initialen Therapieansprechen bleibt eine persistierende Tumorzellpopulation zurück. Diese erlangt schließlich aufgrund der erworbenen Mechanismen die Fähigkeit zur Proliferation unter Therapie zurück und führt zur erneuten Tumorprogression. Im Folgenden werden die bislang erforschten sekundären Resistenzmechanismen gegen die selektiven BRAF- und MEK-Kinase-Inhibitoren vorgestellt.


Neue RAS-Mutationen

Ohne Therapie-Selektionsdruck kommen BRAF- und NRAS-Mutationen fast immer gegenseitig exklusiv vor (33). Unter BRAFi-Therapie führen jedoch neu auftretende RAS-Mutationen in Melanomzellen zu einer BRAF-unabhängigen Hyperaktivierung des MAPK-Signalwegs und stellen die mit am häufigsten beschriebenen Resistenzmechanismen dar (12, 34-40). Man geht davon aus, dass in Zellen mit onkogenem RAS die Signalweiterleitung über CRAF (unabhängig von BRAF) erfolgt (34), ähnlich der paradoxen Hyperaktivierung: hierbei kommt es in nicht-mutierten BRAF-Wildtyp-Zellen zu einer Heterodimerisierung von CRAF mit BRAFi-gebundenem Wildtyp-BRAF, was wiederum zur Phosphorylierung von MEK und ERK und damit zur Reaktivierung des MAPK-Signalwegs unter BRAFi führt. Dies konnte sowohl in vitro an resistenten Zelllinien (35) als auch in klinischen Proben in vivo bestätigt werden (36, 37, 39). Rizos et al. fanden in 8% (3/38) der untersuchten resistenten Tumore onkogene Mutationen in NRAS. In einer multizentrischen Meta-Analyse zur erworbenen Resistenz gegen BRAFi wurden in 26/132 Fällen neue NRAS- (17%) oder KRAS-Mutationen (2%) identifiziert. Das unterstreicht die Bedeutung von onkogenem RAS bei der Resistenzentwicklung gegen BRAFi.


Aktivierende MEK1/2-Mutationen

Aktivierende MEK1-Mutationen wurden bereits früh in der BRIM-2-Studie beschrieben (41). In dieser Kohorte war eine Resistenz häufig mit Mutationen in NRAS oder MEK1 assoziiert. Dabei wurden neue Einzel-Nukleotid-Varianten (SNV) gefunden, welche sich in die aktivierenden Mutationen MEK1 Q56P und E203K übersetzen lassen (40). Eine weitere MEK1-Mutation (MEK1P124Q/S) kommt bereits häufiger als Baseline-Mutation in Therapie-naiven Patienten vor (12/123) und scheint die Ansprechrate (33% versus 72%, p=0,018) sowie das mediane PFS (3,1 Monate versus 4,8 Monate; p=0,004) bei BRAFi gegenüber der Wildtypform abzusenken (40, 42). In anderen Studien wurden MEK1/2-Mutationen in 7% (37) und 8% (39) der Fälle als ursächliche Resis-tenzmechanismen identifiziert und waren zumindest teilweise mit einer hepatischen Metastasierung assoziiert.

 

ERK1/2-Mutationen

Mutationen in den MAPK-Genen unterhalb von RAF können ebenfalls Resistenz gegen BRAFi/MEKi vermitteln. In einem Mutagenese-Screening wurden verschiedene Mutationen in ERK1 (MAPK3) und ERK2 (MAPK1) identifiziert, die Resistenzen gegen BRAFi/MEKi und auch ERKi bewirkten (43). In diesem in-vitro-Ansatz waren Zellen mit Mutationen, die ERKi-Resistenz vermittelten, anfällig für eine BRAFi/MEKi-Kombinationstherapie und umgekehrt. Daher könnte ein wechselndes Therapiekonzept aus BRAFi/MEKi und ERKi unter Umständen die Ausbildung von klinisch refraktären Melanomen hinauszögern.


Mutationen im PI3K-Signalweg

Neben den zuvor erwähnten Mutationen in Genen des MAPK-Signalwegs spielen SNV in Genen des PI3K-Signalwegs für die sekundäre Resistenz gegen BRAFi eine wichtige Rolle (31, 38, 39). Dies können Mutationen in AKT1 sein, wie AKT1 Q79K und E17K, in den katalytischen Untereinheiten der PI3K wie PI3KCA und PI3KCG, sowie in den negativ-regulatorischen Genen PI3KR2, PTEN und PHLPP1 (38, 44). Insgesamt wurden in ca. 22% der resistenten Melanome derartige Aberrationen im PI3K/AKT-Sig-nalweg mittels Whole-Exome-Sequenzierung (WES) nachgewiesen (38).


RAF-Isoform Switching

Drei verschiedene RAF-Isoformen sind bekannt (ARAF, BRAF, CRAF/RAF-1) (45, 46). Daher ist der Wechsel von BRAF zu anderen Isoformen ein logischer Escape-Mechanismus zur Umgehung der BRAF-Inhibition in Melanomzellen. In einem Melanom-Zellkulturmodell wurde von der Arbeitsgruppe um Herlyn gefunden, dass die Blockade von BRAFV600E in Kombination mit einer weiteren RAF-Isoform die Phosphorylierung und damit Aktivierung von ERK in BRAFi-resistenten Zellen nicht vollständig unterbinden kann. Dies führte zur Hypothese, dass bereits eine alternative RAF-Isoform zur Signalweiterleitung mit Aktivitätserhalt des MAPK-Signalwegs genügt (47). Dies eröffnet gleichzeitig die Möglichkeit der Überwindung von erworbenen Resistenzen durch RAF-Isoform-Switching mittels pan-RAF-Inhibitoren (48, 49).


Erhöhte CRAF-Expression

Eine vermehrte Expression von CRAF führt ebenfalls zur Resistenz gegenüber BRAFi (34, 50). In einem in-vitro-Modell wurden von Montagut et al. in resistenten Klonen nach chronischer Behandlung mit dem BRAF-Inhibitor AZ628 erhöhte CRAF-Proteinmengen detektiert (50). Auch hier fand folglich ein Wechsel von BRAF auf CRAF in der Signaltransduktion statt. Eine Heterodimerisierung von BRAF und CRAF (wie zuvor unter RAS-Mutationen beschrieben (34)) und eine artifiziell ektopisch überexprimierte konstitutiv aktive CRAF-Mutante konnten ebenso Resistenz gegen BRAFi induzieren und führten zu einer ERK Aktivierung trotz BRAFi (11).


Alternatives BRAFV600E-Splicing

Bereits früh wurde entdeckt, dass unter BRAFi neue Splicevarianten des BRAF-RNA-Transkripts auftauchen, die mit einer Resistenz gegen BRAFi assoziiert zu sein schienen (37-39). Bald wurde gezeigt, dass Varianten, welche die Exons 4-8 (RAS-bindende Domäne) aussparen, selbst bei sehr geringer RAS-Aktivität zur Dimerisierung von BRAF führen und auf diese Weise den MAPK-Signalweg anschalten. Dadurch verliert eine BRAF-Inhibition an Wirkung. Dies konnte sowohl in Zellkulturmodellen als auch in klinischen Proben gezeigt werden (51). Weiter wurde von Johnson et al. (37) beschrieben, dass solche Splice-varianten in 16% der untersuchten resistenten Melanome detektierbar waren, bei Rizos et al. (39) waren es sogar 32%. Als Ergänzung hierzu wurde in 12% bzw. 8% der resistenten Tumore eine Amplifikation von BRAF festgestellt, wodurch die Effizienz von BRAFi ebenfalls herabgesetzt wird. Für den gewünschten Therapieeffekt wird dann eine erhöhte Dosis benötigt (52).


Erhöhung der RTK-Expression

Eine erhöhte Aktivität des MAPK-Signalwegs kann ebenso durch eine verstärkte Aktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen wie z.B. Wachstumsfaktorrezeptoren erfolgen. Insbesondere PDGFRβ wurde in resistenten Zellen und Tumoren mehrfach als hyperaktiviert und überexprimiert identifiziert (35-37, 39). Da das Signalling von PDGFRβ auch den PI3K-mTOR-Signalweg aktiviert, wurden Kombinationen aus BRAF/PI3K/mTOR-Inhibitoren sowie MEK/PI3K/mTOR-Inhibitoren als effiziente Strategien zur Resistenzüberwindung entwickelt (53). Weitere RTK stehen im Zusammenhang mit der Entwicklung erworbener Resistenz gegen BRAFi und BRAF/MEKi. Darunter sind IGF1R (10, 47), PDGFRα (54), EGFR (55) und EPHA2 (56). Auch hier sind Kombinationstherapien mit spezifischen RTKi zur Überwindung der Resistenz denkbar.

 

Verlust oder Reduktion von MITF

MITF ist der Masterregulator in der Melanozytenentwicklung und daher auch in der Biologie des Melanoms von entscheidender Bedeutung. Ihm wird dabei eine onkogene Wirkung beigemessen. Seine Rolle in der Resistenzentwicklung ist nicht komplett geklärt. Die MITF-Expression scheint mit 3 verschiedenen Melanom-Phänotypen assoziiert zu sein. Für die Differenzierung werden hohe Proteinlevel benötigt, im proliferativen Phänotyp werden mittlere Proteinlevel detektiert und ein invasiver Phänotyp ist mit geringer MITF-Expression verknüpft (57). Häufig wird die Expression und Aktivierung von RTKs, wie PDGFRβ und EGFR, negativ durch MITF reguliert. In Therapie-naiven Patienten wurde eine derartige inverse Korrelation von erniedrigter MITF-Expression und erhöhter RTK-Expression bestätigt. Nach erworbener Resistenz korrelierte eine Reduktion von MITF wiederum mit erhöhter Expression der RTK AXL (57). Ein niedriges Verhältnis von MITF zu AXL war in derselben Studie geeignet, um eine frühe Resistenzentwicklung gegen BRAFi und MEKi vorherzusagen. Umgekehrt sind Kombinationstherapien, die auf RTK wie AXL abzielen, geeignet, um Resistenzen gegen BRAFi/MEKi zu überwinden. Eigene Arbeiten konnten bestätigen, dass eine niedrige MITF-Expression häufig mit der erworbenen Resistenz in Zellkulturmodellen einhergeht und dass diese mit erhöhter Expression von β-catenin und Stat3-Aktivität zusammenhängt (58).


BRAFi/MEKi-Resistenz

Die Resistenz gegen die Kombinationstherapie (BRAFi/MEKi) setzt sich häufig aus verschiedenen BRAFi-Resistenzmechanismen zusammen. So wurde von Moriceau et al. entdeckt, dass Protein-Interaktionen von BRAFV600E mit CRAF und mit mutiertem MEK zu einer Reaktivierung des MAPK-Signalwegs trotz BRAF/MEKi führten und damit die Kombinationstherapie wirkungslos werden ließen (59). Interessanterweise waren in dieser Arbeit die Zellen mit Resistenz gegen die Kombinationstherapie im Gegensatz zu Zellen, die nur resistent gegen BRAFi waren, sehr abhängig von den Wirksubstanzen (drug-addicted). Dies lässt Spekulationen zu, ob in solchen Fällen eine Therapiepause (drug holiday) mit anschließender Re-Initiierung (On-Off-Schema) von Vorteil sein könnte.


Notch-Signalling

Aktiviertes Notch1 konnte kürzlich in vitro mit der Resistenz gegen Inhibitoren auf verschiedenen Ebenen des MAPK-Signalwegs (BRAFi, MEKi und ERKi) funktionell in Verbindung gebracht werden (60). In einigen Melanomen ist darüber hinaus Notch1 basal aktiviert, was Notch als mögliche Zielstruktur identifiziert. Dies scheint besonders für die Kombination mit ERKi zu gelten. Krepler et al. fanden einen funktionellen Zusammenhang von Notch-Signalling und der Resistenz gegen ERKi, und eine Kombination aus NOTCH/ERKi zeigte eine signifikante Steigerung der Wachstumsinhibition und Apoptoseinduktion in der Zellkultur und im Mausmodell (26).


Adaptionsmechanismen

Von einer adaptiven Resistenz gegen BRAFi/MEKi kann man bei Patienten sprechen, die zwar anfänglich auf die Therapie ansprechen, dann aber sehr rasch eine Resistenz entwickeln. Hierbei sind die Übergänge zur erworbenen/-sekundären Resistenz sicher fließend.


Negatives ERK-Feedback

Innerhalb des MAPK-Signalwegs kommt es physiologisch zu einer negativen Feedback-Hemmung, um das Signal intrinsisch zu regulieren und zu limitieren. Die Behandlung von BRAFV600E-mutierten Melanomen mit BRAFi beeinträchtigt diese Feedback-Hemmung (61). Durch BRAFi wird die ERK-Aktivität herabgesetzt und damit das ERK-Feedback vermindert. Hieraus resultiert eine verstärkte RAS-Phosphorylierung und nachgeschaltet eine erleichterte Ausbildung von RAF-Dimeren (ohne BRAFV600E-Beteiligung), die nicht von BRAFi inhibiert werden können. Dadurch kommt es zu einem neuen BRAFV600E-unabhängigen Gleichgewicht mit BRAFi-resis-tenter ERK-Aktivität. Diese kann jedoch durch MEKi inhibiert werden; deshalb ist die Kombinationstherapie BRAFi/MEKi der BRAF-Monotherapie überlegen und wurde zum Standard für BRAFV600-mutierte Melanome.


MITF-Hochregulation/MITF-Amplifikation

Wie zuvor beschrieben, ist die Bio-logie von MITF komplex. Mehrere Arbeitsgruppen fanden einen Zusammenhang zwischen erhöhter MITF-Expression und adaptiver Resistenz gegen BRAFi (31, 62-65). Dies kann durch epigenetische Hochregulation der Expression sowie durch Gen-amplifikation erfolgen. MITF selbst hat überlebensfördernde Funktionen und ist dadurch direkt mit der Therapie-resistenz gegen MEK- (66) und MAPK-Signalwegsinhibition (31) verknüpft. Auch in Patientenproben konnte dies gefunden werden (64). Interessanterweise steigt die Genexpression von MITF-Zielgenen unter BRAFi zunächst an (65), was die Adaption unterstreicht. Diese Adaption ist notwendig, da durch BRAFi und dem damit inhibierten MAPK-Signalweg eine metabolische Umstellung erfolgen muss. Dabei wird die mitochondriale Atmung erhöht und mehr reaktive Sauerstoffspezies in den Mitochondrien produziert. Dies geht einher mit einer durch MITF-regulierten Expression von PGC1α (62). Interessanterweise scheinen Melanomzellen dann anfälliger für pro-oxidative Substanzen wie Elesclomol zu sein. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für zukünftige Kombinationstherapie-Konzepte mit z.B. Elesclomol (67) oder Hochdosis-Vitamin C (68).


FOXD3-Hochregulation

FOXD3 ist ein Forkhead-Box-Transkrip-tionsfaktor und wirkt als negativer Regulator des Zellzyklus (69). Die Expression wird von BRAF und dem MAPK-Signalweg beeinflusst. BRAFi induziert eine erhöhte Expression von FOXD3 (und damit einen transienten Proliferationsarrest), was zu einer Reduktion des durch BRAFi induzierten Zelltodes führt (70). Kürzlich wurde gezeigt, dass eine FOXD3-Aktivität außerdem zu einer vermehrten Expression des NRG1-Rezeptors ERBB3 führt (71). Das NRG1-Signalling ist als Resistenzmechanismus mehrfach beschrieben worden (4, 5) und kann über ERBB3 zu einer Aktivierung des PI3K-Signalwegs führen.

 

Veränderungen im PI3K/AKT-Signalweg

Die adaptive Resistenz wurde, wie zuvor beschrieben, mit dem PI3K-Signalweg in Verbindung gebracht, und während der Adaption an BRAFi/MEKi wird häufig der PI3K-Signalweg aktiviert (38, 47, 53). Die basale Aktivität des Signalwegs zusammen mit dieser Aktivierung rechtfertigen die aktuelle Erforschung von Kombinationstherapien aus MAPK- und PI3K/AKT-Inhibitoren (72). Delmas et al. fanden her-aus, dass BRAF-Inhibition c-Jun/RHOB/AKT aktiviert und eine AKT-Inhibition synergistisch mit BRAFi wirkt (73).

Der PI3K/AKT-Signalweg ist direkt mit Zellproliferation, Differenzierung und Zellüberleben verknüpft. Dabei werden auch pro-apoptotische Proteine negativ reguliert. Liegen Aberrationen wie aktivierende Mutationen in AKT1 vor, wird die adaptive Aktivierung des PI3K/AKT-Signalwegs weiter verstärkt. Daher erscheint eine Kombination aus AKT- und MAPK-Inhibiton wie z.B. durch die Triple-Therapie AKTi plus BRAFi/MEKi vielversprechend zu sein, um Resistenzen zu vermeiden (73).


BRAFi und Immunantwort

Die zielgerichtete Therapie gegen BRAF und MEK moduliert ebenfalls die Immunantwort. So kommt es in BRAF-mutierten Melanomzelllinien nach erfolgter BRAF/MEK-Inhibition zu einem veränderten Sekretionsprofil von Zytokinen und Wachstumsfaktoren (74). Verminderte Mengen an INFα2A, IL-7, IL-8, CX3CL1, G-CSF und VEGF sind beschrieben. BRAFi/MEKi führte überdies zu einer veränderten Expression von Oberflächenmarkern wie z.B. der Hochregulation von β2-Mikroglobulin oder der Herabregulation von NKG2D-Liganden (MICA/B) und TRAIL-Rezeptoren (TRAIL-R2).

Der Einsatz von Mutations-spezifischen BRAFi führte außerdem zur Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Melanom-assoziierten Makrophagen, was wiederum eine gesteigerte VEGF-Produktion und damit ein besseres Melanomzellwachstum bewirkte (75). Dies konnte durch eine spezifische Blockade von VEGF verhindert werden. Ebenso führte eine Blockade des G-CSF-Rezeptors 1 zu einer Reduktion der unerwünschten Wirkung von BRAFi auf Makrophagen und myeloiden Suppressorzellen (MDSC). Dies verdeutlicht, dass die Kombination von BRAFi mit MEKi sehr hilfreich ist, um die paradoxe Hyperaktivierung in BRAF-Wildtyp-Zellen zu umgehen und es zukünftig weitere Kombinationen mit Immuntherapien geben wird.

Eine gleichzeitige BRAF- und MEK-Inhibition verändert in Tumorbiopsien die immunologische Mikroumgebung des Tumors, wodurch die relative Anzahl der CD8+ T-Zellen gesteigert wird. Dabei wird vor allem die Anzahl immunsuppressiver Zellen wie MDSC und regulatorischer T-Zellen vermindert (76). Außerdem erhöht sich die Expression der Melanom-Differenzierungsantigene wie MART-1 und gp-100 im Tumor (siehe Adaption und MITF), was sich günstig auf die T-Zell-Erkennung auswirken kann (65, 77, 78). In Mausexperimenten wurde bereits gezeigt, dass sich diese Effekte in einem besseren Überleben der Tiere nach der Kombination von BRAF/MEK-Inhibitoren mit einer Anti-PD1-Therapie niederschlagen. Die aktuell initiierten klinischen Studien werden zeigen, ob dies auch den Patienten einen Überlebensvorteil bringt (79).

Interessanterweise fanden Hugo et al. in BRAFi/MEKi-resistenten Tumoren vermehrt erschöpfte CD8+ T-Zellen und weniger CD8+ T-Zell-Infliltration. Dies könnte zu einer Kreuzresistenz gegen Anti-PD-1/Anti-PD-L1-Antikörper führen (80).


Fazit

Die Vielzahl der möglichen Resistenzmechanismen verdeutlicht, wie wichtig eine tiefe personalisierte Diagnostik für die Zukunft der zielgerichteten Therapien werden wird. Neben der Identifizierung von Resistenzmechanismen (durch z.B. Panel-Sequenzierungen) bleibt die Frage offen, ob die derart identifizierten Treiber erstens pharmakologisch adressiert und zweitens auch im Einzelfall wirklich effektive Zielstrukturen darstellen. Daher gewinnen künftig sicher auch funktionelle Testungen zur Resistenzüberwindung und Therapie-Individualisierung an Patienten-abgeleiteten Zellmodellen an Bedeutung.


 
Dr. rer. nat. Tobias Sinnberg Dr. rer. nat. Tobias Sinnberg

Universitätshautklinik Tübingen
Liebermeisterstr. 25
72076 Tübingen

Tel.: 07071/2984594
Fax: 07071/295187
E-Mail: tobias.sinnberg@med.uni-tuebingen.de












 
ABSTRACT

T. Sinnberg, T. Amaral, Universitätshautklinik Tübingen
 

The approval of targeted therapies against mutated BRAF led to a paradigm shift in the therapeutic world of metastatic melanoma. Further milestones were the introduction of combined BRAF/MEK inhibition and the checkpoint inhibitors as novel immunotherapeutics. These therapies led to an improved progression free survival and overall survival of stage IV melanoma patients. Although targeted therapies and immunotherapies show a plateau in the survival curves representing the long-term responders, there is a relevant number of patients that progress under targeted therapy. It is evident that a deep knowledge about the underlying resistance mechanisms as well as strategies to overcome resistance are of relevance and could point the way towards novel targeted combination therapies.
 

Keywords: BRAF, metastatic melanoma, MEK, checkpoint inhibitors, immunotherapeutics, resistance