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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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20. April 2011

Säurelabile Nanotransporter als neuartige Drug-Delivery-Systeme zur Behandlung von Krebserkrankungen

Marcelo Calderón1, Rainer Haag1 und Felix Kratz2 ; 1Institut für Chemie und Biochemie, Freie Universität Berlin, 2Klinik für Tumorbiologie, Freiburg

Die zur chemotherapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzten Zytostatika weisen ein schmales therapeutisches Fenster auf. Nach ihrer Verabreichung verlassen sie rasch die Blutgefäße und verteilen sich gleichmäßig im gesamten Organismus, ohne eine Anreicherung in soliden Tumoren aufzuweisen. Als Folge lässt es sich nicht vermeiden, dass im Verlauf der Behandlung auch gesundes Gewebe geschädigt wird. Dies äußert sich in den schwerwiegenden Nebenwirkungen der Zytostatika oder anderer antitumoraler Wirkstoffe, welche sich letztlich dosislimitierend auswirken. Wenn die operative Entfernung des Tumors oder eine gezielte Strahlentherapie keine Optionen darstellen, kann die Chemotherapie nur in etwa 10-20% der Fälle mit kurativem Ziel eingesetzt werden, in aller Regel erfolgt die medikamentöse Behandlung adjuvant bzw. meist palliativ als Kombinationstherapie. Die Entwicklung nebenwirkungsarmer und tumorselektiver Medikamente ist deshalb eine Forschungsaufgabe, die einer dringenden Lösung bedarf.
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Makromoleküle, wie etwa Blutproteine, synthetische Polymere oder Nanopartikel, bieten neue Möglichkeiten, Zytostatika im Tumor anzureichern. Untersuchungen auf dem Gebiet der experimentellen Tumordiagnostik haben gezeigt, dass sich Polymere mit einem Mindestdurchmesser von etwa 3-4 nm bevorzugt im Tumorgewebe anreichern. Pionierarbeiten zu diesem Themengebiet sind bereits 1986 in Japan durchgeführt worden [1] und hängen sowohl mit den anatomisch-physiologischen Eigenschaften von Tumorgewebe als auch mit den pharmakokinetischen Eigenschaften von Makromolekülen zusammen: Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung eines Blutgefäßes, das im oberen Bereich an normales Gewebe und im unteren Bereich an Tumorgewebe angrenzt.

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Abb. 1: Schematische Darstellung des sogenannten EPR-Effekts (enhanced permeability and retention), der für eine Anreicherung von Makromolekülen in soliden Tumoren aufgrund einer erhöhten kapillaren Durchlässigkeit in Verbindung mit einem mangelnden Abtransport aus dem Tumorgewebe verantwortlich ist. Das obere Gewebe ist von einer intakten, lückenlosen Endothelschicht umgeben (elektronenmikroskopische Aufnahme (A)); im Gegensatz dazu besteht das die Gefäßwand auskleidende Endothel aus einem ungeordneten, lückenhaften Zellverband und ist durch größere Fenestrierungen gekennzeichnet (B).

Blutgefäße im gesunden Gewebe weisen mit wenigen Ausnahmen eine geschlossene Endothelschicht auf, die zwar das Eindringen von niedermolekularen Verbindungen, nicht aber das von Makromolekülen erlaubt, während die lückenhafte, poröse Endothelschicht im Bereich von Tumorgewebe sowohl für kleine als auch für große Moleküle durchlässig ist. Dieser Unterschied hat zur Folge, dass Makromoleküle bevorzugt in Tumorgewebe eindringen. Da dieses in der Regel kein abführendes lymphatisches System besitzt, kommt es aufgrund des mangelnden Abtransports zu einer Anreicherung der Makromoleküle. Diesen passiven Mechanismus der Akkumulation von Makromolekülen hat man im Englischen „enhanced permeability and retention“ (EPR) genannt [2].

Die erhöhte Aufnahme von Makromolekülen in tumortragenden Mäusen lässt sich durch verschiedene diagnostische Verfahren nachweisen. Eine Anreicherung des Plasmaproteins Albumin mit einer Größe von 3-4 nm in soliden Tumoren ist exemplarisch für Farbstoff-markiertes Albumin in Abbildung 2 mit Hilfe des Nahinfrarot-Imagings dargestellt.

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Abb. 2: Anreicherung von Albumin in einem subkutan wachsenden Tumor in einer Nacktmaus nach 24 h. Albumin wurde mit einem Indotricarbocyanin markiert, einem Farbstoff, der durch anschließende Bestrahlung im Nahinfrarot-Bereich des Lichtspektrums (> 740 nm) fluoresziert und dadurch sichtbar wird.

Jain und Mitarbeiter haben diesbezüglich an Nacktmausmodellen die vaskuläre Durchlässigkeit von Humantumoren für verschiedene Verbindungen in Abhängigkeit von deren Molekülgröße bestimmt: Serumproteine, synthetische Polymere sowie Nanopartikel (bis zu 500 nm Durchmesser) sind in der Lage, die großporige Endothelschicht von Tumorgewebe zu durchwandern und auf diesem Wege zu den Tumorzellen zu gelangen [3].

Bei Drug-Delivery-Systemen in der Onkologie unterscheidet man partikuläre Träger (Liposomen, Mikro- und Nanopartikel) und lösliche Träger (Antikörper, synthetische Polymere, Proteine bzw. Liganden). Maßgeschneiderte Drug-Delivery-Systeme sollen einerseits einen gezielten Transport des verkapselten oder kovalent gebundenen Wirkstoffs ins Tumorgewebe (Drug Targeting) und andererseits ein effizientes und möglichst spezifisches Freisetzen des Wirkstoffs am Zielort ermöglichen (Controlled Release) [4, 5].

Insbesondere im Bereich der Nanotechnologie können innovative Problemlösungen für Drug-Delivery-Systeme erarbeitet werden, um effiziente Nanotransportsysteme zu entwickeln, wie im Folgenden ausgeführt wird [6].

Entwicklung von säurelabilen tumorhemmenden Nanotransportern*

Geeignete Nanotransporter sind durch eine geeignete Größe im Bereich von 10-30 nm gekennzeichnet, da dieser Größenbereich zum einen eine ausreichend hohe Beladung mit Wirkstoffen erlaubt, zum anderen größere Partikel dazu neigen, unspezifisch von der Leber und Milz abgefangen zu werden. In einer langjährigen Zusammenarbeit zwischen der FU Berlin und der Klinik für Tumorbiologie ist es gelungen, Nanotransporter mit dem Zytostatikum Doxorubicin zu entwickeln, die sich aus folgenden Strukturelementen zusammensetzen:

• Polyglycerol (PG) als baumartig verzweigter Kern des Nanotransporters

• 5-10 Moleküle Doxorubicin, die über eine säurelabile Bindung an den Kern gebunden sind

• ein den Nanotransporter umhüllender „Mantel“ mit dem Polymer Polyethylenglykol, das in seiner Länge beliebig variiert werden kann.

Polyglycerole (Abb. 3) gehören zur Gruppe der dendritischen Polymere, die sich aufgrund ihres geordneten dreidimensionalen Aufbaus gezielt zu Drug-Delivery-Systemen funktionalisieren lassen. Das Einfügen geeigneter chemischer Gruppen ermöglicht zudem die Komplexierung mit Metallionen oder das Binden an Oberflächenmolekülen auf Zellen, so dass sich multivalente Systeme mit antifungalen oder entzündungshemmenden Eigenschaften realisieren lassen (www.polytree.de).

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Abb. 3: Darstellung eines Polyglycerols. Die unterschiedlichen Hydroxygruppen erlauben eine gezielte weitere Modifikation zu Nanopartikeln.

Für die Anwendung als Drug-Delivery-Systeme in der Onkologie ist der schematische Aufbau der Wirkstoff-Nanotransporter in Abbildung 4 dargestellt.

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Abb. 4: Aufbau der Doxorubicin-Nanotransporter und Freisetzung des Zytostatikums im sauren Milieu.

Um Wirkstoffe effektiv und selektiv im Tumorgewebe freizusetzen, haben wir eine säurelabile Freisetzung mit dem Zytostatikum Doxorubicin realisiert, ein klinisch etablierter Wirkstoff aus der Stoffklasse der Anthrazykline, der bereits seit mehren Jahrzehnten zur Behandlung von Brustkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Hodgkin-Lymphomen und Leukämien eingesetzt wird. Entscheidend für die Anwendbarkeit einer Freisetzungsstrategie ist der Mechanismus der zellulären Aufnahme der Doxorubicin-Nanotransporter, welche – im Gegensatz zu niedermolekularen Arzneistoffen – nicht durch Diffusion durch die Zellmembran, sondern durch Endozytose aufgenommen werden. Durch eine Protonenpumpe sinkt der pH-Wert in den intrazellulären Endosomen von ursprünglich 7,2-7,4 in der Blutbahn auf 6,5-5,0, bei nachfolgender Umwandlung in Lysosomen sogar auf ~ pH 4,0. Aber auch im extrazellulären Raum liegt der pH-Wert in Tumorgewebe häufig um 0,5-1,0 Einheiten niedriger als in gesundem Gewebe, was durch einen anaeroben Stoffwechsel begründet wird [7]. Insbesondere der deutliche pH-Sprung nach zellulärer Aufnahme lässt sich gezielt für das Design säurelabiler Sollbruchstellen ausnutzen. Eine Methode, Wirkstoff und Träger säurelabil zu verknüpfen ist die Anbindung des Wirkstoffs über eine Acylhydrazon-Bindung. Acylhydrazone zeichnen sich durch hohe Stabilität in pH-neutralen Medien (Blut und Gewebeflüssigkeiten) aus. Bei pH 5 erfolgt indes eine rasche und quantitative Spaltung, die sich in idealer Weise zur tumorspezifischen Freisetzung von Wirkstoffen ausnutzen lässt. Derart aufgebaute Wirkstoffe nennt man Prodrugs, da sie den ursprünglichen Wirkstoff (drug) beinhalten und diesen im Körper gezielt freisetzen.

Dieser Ansatz hat sich in der Vergangenheit sowohl präklinisch als auch klinisch bei dem von uns entwickelten Albumin-bindenden Doxorubicin-Prodrug DOXO-EMCH (6-Maleinimidocaproylhydrazon-Derivat von Doxorubicin, s. Abb. 5) bewährt [8].

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Abb. 5: Struktur von DOXO-EMCH, bestehend aus dem Wirkstoff Doxorubicin (rot), der thiolbindenden Malein-imid-Gruppe (blau) und einer säurelabilen Acylhydrazon-Bindung (gelb).

Für die Synthese der Doxorubicin-Nanotransporter wurden 5 bis 10 Moleküle DOXO-EMCH pro Nanotransporter eingeführt und weiterhin zwischen 40 und 110 Polyethylenglykolmoleküle an den Innenkern gebunden, so dass dieser von einem sphärischen Polymermantel umgeben wird. Dieser schützt zum einen das eingeführte Prodrug vor einem frühzeitigen und unerwünschten Abbau in der Blutbahn, zum anderen ist von anderen Wirkstoffträgern, wie etwa bei Liposomen, bekannt, dass das Einführen des inerten und nicht toxischen Polyethylenglykols den Träger maskiert und eine Aufnahme durch Makrophagen sowie durch die Leber und Milz unterdrückt.

Die so hergestellten Doxorubicin-Nanotransporter PG-DOXO-EMCH zeigten eine rasche Freisetzung des Wirkstoffs bei pH 4,0 mit Halbwertszeiten von 2-3 h und eine ausgeprägte Stabilität in Blutplasma. Ferner zeigten sie in der Zellkultur bei Tumorzellen eine intrazelluläre Freisetzung von Doxorubicin und eine tumorhemmende Wirksamkeit im unteren mikromolaren Konzentrationsbereich sowie steile Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die typisch für Zytostatikaderivate sind.

In Nacktmäusen zeigten die Doxorubicin-Nanotransporter eine deutlich verbesserte Verträglichkeit und konnten ohne Weiteres bei der dreifachen Dosierung gegenüber dem klinischen Standard Doxorubicin (2x 8 mg/kg Doxorubicin) verabreicht werden. In einem Ovarialkarzinom-Xenograft-Modell (A2780) zeigten die Polyglycerol-Doxorubicin-Konjugate PG-DOXO-EMCH mit Beladungen zwischen 5 und 10 und einer Größe von 11-16 nm (PG-DOXO-EMCH 149, PG-DOXO-EMCH 150 und PG-DOXO-EMCH 155) bei einer Dosis von 3x 24 mg/kg Doxorubicin-Äquivalenten eine sehr gute antitumorale Wirksamkeit mit lang anhaltenden Tumorremissionen (s. Abb. 6) bei ausgezeichneter Verträglichkeit, ohne Körpergewichtverluste am Ende des Versuchs zu verursachen. Im Vergleich zum klinischen Standard Doxorubicin bei seiner optimalen Dosis von 2x 8 mg/kg waren sie hinsichtlich Wirksamkeit und Verträglichkeit signifikant überlegen, da die mit Doxorubicin behandelte Gruppe lediglich eine moderate Tumorhemmung gegenüber der Kontrollgruppe aufwies und einen Gewichtsverlauf von -20%, ein deutliches Zeichen für eine Therapie-bedingte systemische Toxizität, zeigte.

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Abb. 6: Ergebnisse der Wirksamkeitsstudie mit PG-DOXO-EMCH 149, PG-DOXO-EMCH 150, PG-DOXO-EMCH 155 und Doxorubicin im A2780 Ovarialkarzinom-Xenograft-Modell. Gezeigt sind die Wachstumskurven der subkutan implantierten Tumoren; Dosen für Doxorubicin: 2x 8 mg/kg; Dosen für PG-DOXO-EMCHs: 3x 24 mg/kg Doxorubicin-Äquivalente.

Durch diese Ergebnisse ist ein überzeugendes Proof-of-Concept für säurelabile Polyglycerol-Doxorubicin-Konjugate erbracht worden. Dies ist ein wichtiger Meilenstein bei der Entwicklung eines neuen Drug-Delivery-Systems, da das Aufzeigen von Tumorremissionen, nicht lediglich einer Tumorhemmung, im präklinischen Tiermodell die Möglichkeit einer klinischen Tumorrückbildung bei einer weiteren Entwicklung vom Labor bis zur Klinik überhaupt greifbar macht.

Die Entwicklung dieser ersten Generationen von Wirkstoff-Nanotransportern weist zudem die wesentlichen Eigenschaften einer Plattform-Technologie auf: Sie können sowohl mit einem Spektrum von Wirkstoffen beladen werden als auch mit Kombinationen von Wirkstoffen, ihre Größe kann beliebig variiert werden, und sie können zusätzlich mit Liganden versehen werden, die tumorassoziierte Rezeptoren oder Antigene anvisieren, um ein passives mit einem aktiven Tumor-Targeting zu vereinen.

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Diese Arbeit wurde mit dem Arthur Doolittle Award bei dem diesjährigen Annual American Chemical Society (ACS) Meeting in Anaheim, USA, am 30. März 2011 ausgezeichnet, der die Entwicklung innovativer Polymer-basierter Wirkstoff-Transporter würdigt.

7 Dr. rer. nat. Felix Kratz

Leiter der Abteilung Makromolekulare Prodrugs
Klinik für Tumorbiologie
Breisacher Straße 117
79106 Freiburg i. Brsg.

Tel.: 0761/206-2930,
Fax: 0761/206-2905

Email: kratz@tumorbio.uni-freiburg.de


Literatur
1. Matsumura Y, Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 1986, 46, 6387-6392.
2. Maeda H, Wu J, Sawa T, Matsumura Y, Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Controlled Release 2000, 65, 271-284.
3. Jain RK. Transport of molecules in the tumor interstitium: a review. Cancer Res. 1987, 47, 3039-3051.
4. Haag R, Kratz F. Polymer therapeutics: concepts and applications. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1198-1215.
5. 5. Kratz, F.; Muller, I. A.; Ryppa, C.; Warnecke, A. Prodrug Strategies in Anticancer Chemotherapy. ChemMedChem. 2008, 3, 20-53.
6. Riehemann K, Schneider SW, Luger TA, Godin B, Ferrari M, et al. Nanomedicine – challenge and perspectives. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48, 872-897.
7. Tannock IF, Rotin D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Res. 1989, 49, 4373-4384.
8. Kratz, F. DOXO-EMCH (INNO-206): the first albumin-binding prodrug of doxorubicin to enter clinical trials. Expert. Opin. Investig. Drugs 2007, 16, 855-866.

*Die Originalpublikation steht online zur Verfügung:
Calderon, M.; Welker, P.; Licha, K.; Fichtner, I.; Graeser, R. et al. (2011): Development of efficient acid cleavable multifunctional prodrugs derived from dendritic polyglycerol with a poly(ethylene glycol) shell. J Control Release.[Epub ahead of press] doi:10.1016/j.jconrel.2011.01.017.
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