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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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13. Oktober 2015

Molekulare Typisierung und Graduierung des kolorektalen Karzinoms

J. Neumann, T. Kirchner, Pathologisches Institut der Ludwig-Maximilians Universität München.

Sporadische Kolorektalkarzinome (CRC) mit Mikrosatelliteninstabilität weisen nur ein geringes Fernmetastasierungsrisiko auf. In der aktuellen WHO-Klassifikation und der S3-Leitlinie für das CRC von 2013 werden Sonderformen des CRC (muzinös, siegelringzellig, serratiert, cribriform-comedoartig und solid-undifferenziert) anhand ihres Mikrosatellitenstatus molekular in low grade und high grade Karzinome graduiert. In der täglichen Routine kann für die molekulare Graduierung die Immunhistochemie für hMLH1 und hMSH2 zum Nachweis eines Mismatch-Reparaturgendefekts an die Stelle einer molekularpathologischen Mikrosatelliten-Analyse treten. Der Nachweis einer BRAF-Mutation bei einer Mikrosatellitenstabilität ist mit einer sehr schlechten Prognose assoziiert und zeigt einen sehr aggressiven Subtyp des CRC an.

Morphologische Graduierung

Bei der Typisierung von kolorektalen Karzinomen (CRC) unterscheidet die WHO-Klassifikation von 2010 zwischen den häufigen konventionellen Adenokarzinomen NOS (not otherwise specified) und morphologischen Sonderformen, wie den muzinösen, siegelringzelligen, serratierten, cribriform-comedoartigen oder solid-undifferenzierten Karzinomen. Nur die Adenokarzinome NOS werden nach WHO-Kriterien aufgrund des glandulären Differenzierungsanteils in G1-, G2- und G3-Adenokarzinome graduiert (morphologische Graduierung; Tab. 1) (1). Gut differenzierte Karzinome (G1) lassen in > 95% der Tumorformationen ein glanduläres Baumuster erkennen. Mäßig differenzierte Karzinome (G2) zeigen in 50-95% der Tumorformationen eine Drüsenstruktur, gering differenzierte Karzinome (G3) in nur noch 0-49% der Tumorformationen. Die Kategorie undifferenziertes Karzinom (G4) wird für Karzinome ohne besondere morphologische Differenzierung, d.h. ohne Drüsen und Schleimproduktion und bei Fehlen einer neuroendokrinen, plattenepithelialen oder sarkomatoiden Differenzierung gebraucht. G1/G2-Tumoren können als low grade und G3/G4-Tumoren als high grade zusammengefasst werden.

Tab. 1: Aktuelle Kriterien für die Graduierung von Adenokarzinomen des Dickdarms nach der WHO-Klassifikation (modifiziert nach (1)).
Tab. 1: Aktuelle Kriterien für die Graduierung von Adenokarzinomen des Dickdarms nach der WHO-Klassifikation (modifiziert nach (1)).



Molekulare Graduierung

Erstmals wird in der aktuellen WHO-Klassifikation berücksichtigt, dass CRC mit Mismatch-Reparaturdefekt (MMRD) und Mikrosatelliteninstabilität (MSI) eine signifikant günstigere Prognose aufweisen (2-5). Zahlreiche Studien zeigen, dass das signifikant bessere krankheitsspezifische Patientenüberleben bei MSI-Karzinomen im Vergleich zu mikrosatellitenstabilen (MSS) Karzinomen durch eine signifikant geringere Rate von Metastasen bedingt ist. Dabei kommen Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen bei MSI-Karzinomen seltener vor. Speziell beträgt die Rate von Fernmetastasen bei MSI-Karzinomen nur 7,9% im Vergleich zu 27% bei MSS-Karzinomen (3). Zudem zeigen Lebermetastasen von Dickdarmkarzinomen nur sehr selten eine MSI (0-2,7% der Fälle). Das bedeutet, dass Fernmetastasen in der Leber bei MSI-Karzinomen sehr selten sind (6). Da ein MMR-Defekt bzw. eine MSI sig-nifikant mit morphologischen Sondertypen des CRC assoziiert sind, wird für diese keine morphologische, sondern alleinig die molekulare Graduierung nach dem MSI-Status vorgeschlagen. Sie gilt also für die muzinösen, medullären, siegelringzelligen, serratierten und cribriform-comedoartigen Sonderformen des CRC (1). Die molekulare Graduierung empfiehlt sich zusätzlich bei G3-Adenokarzinomen NOS und undifferenzierten G4-Karzinomen, da sie trotz der schlechten morphologischen Differenzierung bei Vorliegen von MSI als low grade eingestuft werden können. Zusammenfassend sind also G3/G4-Karzinome und morphologische Sonderformen molekular zu graduieren und bei einem Anhalt für MSI als low grade Karzinome und bei einem Anhalt für eine MSS als high grade Karzinome zu bewerten, um dem günstigen Verlauf und der geringen Fernmetastasierungsrate der MSI-Karzinome Rechnung zu tragen (7, 8).

Abb. 1: Dickdarmkarzinome mit prognostisch ungünstigem (molekularer Tumorgrad: high grade; A und B) und günstigem Markerprofil (molekularer Tumorgrad: low grade; C und D). Wenig differenziertes (G3) Adenokarzinom NOS des Dickdarms mit cribriformem Wachstumsmuster (A) mit erhaltener hMLH1-Expression (B). Morphologisch undifferenziertes Dickdarmkarzinom vom medullären Typ (C) mit solidem Baumuster, ausgeprägten intratumoralen lymphozytären Infiltraten und Verlust der hMLH1-Expression (D).
Abb. 1: Dickdarmkarzinome mit prognostisch ungünstigem (molekularer Tumorgrad: high grade; A und B) und günstigem Markerprofil (molekularer Tumorgrad: low grade; C und D). Wenig differenziertes (G3) Adenokarzinom NOS des Dickdarms mit cribriformem Wachstumsmuster (A) mit erhaltener hMLH1-Expression (B). Morphologisch undifferenziertes Dickdarmkarzinom vom medullären Typ (C) mit solidem Baumuster, ausgeprägten intratumoralen lymphozytären Infiltraten und Verlust der hMLH1-Expression (D).

 

Anstelle der MSI-Diagnostik kann für diese molekulare Graduierung der CRC die technisch einfache und kostengünstige Immunhistochemie für hMLH1 und hMSH2 eingesetzt werden, da Expressionsverluste von hMLH1 oder hMSH2 signifikant mit MSI korrelieren (9). Die negative Immunhistochemie für hMLH1 oder hMSH2 zeigt hier den MSI-Typ und somit ein low grade CRC an, die positive Immunhistochemie signalisiert den MSS-Typ bzw. ein high grade Karzinom (Abb. 1). Die molekulare Graduierung anhand der Immunhistochemie von hMLH1 und hMSH2 hat auch Einzug in die aktuell gültige S3-Leitlinie für das CRC von 2013 gefunden (10, 11).


Bedeutung von BRAF-Mutationen für die Prognose

Sporadische Dickdarmkarzinome mit MSI leiten sich häufig von serratierten Polypen, meist sessilen serratierten Adenomen, ab (12, 13). Am Beginn ihrer molekularen Tumorgenese steht überwiegend eine BRAF-Mutation, selten auch eine KRAS-Mutation (Abb. 2). Auf diese Onkogenmutation folgen eine onkogeninduzierte Seneszenz und eine Hypermethylierung von CpG-Inseln in verschiedenen Genpromotoren. Dies bedingt einen CpG-Methylator-Phänotyp mit einer messbaren Methylierung von mehreren Markergenen, die als CIMP definiert wurde.

Abb. 2: Häufige Karzinogenesewege beim CRC. Etwa 80% der CRC entstehen über den Weg der klassischen Adenom-Karzinom-Sequenz, die durch die Akkumulation von Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie APC, KRAS und p53 getrieben wird. Bei der alternativen serratierten Route (etwa 20% der CRC) liegt meist eine Mutation im BRAF-, seltener im KRAS-Onkogen vor, auf die eine Hypermethylierung der CpG-Inseln in verschiedenen Gen-Promotoren folgt. Sie bedingt den CpG island methylator phenotype (CIMP) und in der Regel eine Inaktivierung des hMLH1 Gen-Promotors mit hMLH1-Expressionsverlust in der Immunhistochemie. Es resultiert ein Mismatch-Reparaturdefekt und konsekutiv eine hochgradige MSI (MSI-H) (modifiziert nach (14)).
Abb. 2: Häufige Karzinogenesewege beim CRC. Etwa 80% der CRC entstehen über den Weg der klassischen Adenom-Karzinom-Sequenz, die durch die Akkumulation von Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie APC, KRAS und p53 getrieben wird. Bei der alternativen serratierten Route (etwa 20% der CRC) liegt meist eine Mutation im BRAF-, seltener im KRAS-Onkogen vor, auf die eine Hypermethylierung der CpG-Inseln in verschiedenen Gen-Promotoren folgt. Sie bedingt den CpG island methylator phenotype (CIMP) und in der Regel eine Inaktivierung des hMLH1 Gen-Promotors mit hMLH1-Expressionsverlust in der Immunhistochemie. Es resultiert ein Mismatch-Reparaturdefekt und konsekutiv eine hochgradige MSI (MSI-H) (modifiziert nach (14)).

 

Typische methylierungsbedingte Genexpressionsausfälle betreffen p16, wodurch die onkogeninduzierte Seneszenz überwunden wird, oder hMLH1, wodurch ein MMRD und die Ausprägung von MSI in der Tumorgenese bedingt sind (15, 16). Es wurde daher zunächst angenommen, dass – wie die MSI und der hMLH1-Ausfall – auch die BRAF-Mutation oder CIMP brauchbare Biomarker für eine günstige Prognose und eine geringe Fernmetastasierungsrate des Dickdarmkarzinoms sein könnten. Überraschenderweise haben klinische Studien diese Annahme widerlegt. Nach den Studienresultaten haben Patienten mit BRAF-mutierten Dickdarmkarzinomen im Stadium II und III eine signifikant schlechtere Prognose als Patienten mit Nachweis von BRAF-Wildtyp im Dickdarmkarzinom. Die Erklärung für diesen Befund ist, dass die BRAF-Mutation kombiniert sowohl mit MSI (5-8% der Dickdarmkarzinome) als auch mit MSS (4-6,5% der Dickdarmkarzinome) vorkommt (17, 18). Eine günstige Prognose besteht nur bei Karzinomen mit BRAF-Mutation im Verbund mit MSI, während bei Karzinomen mit BRAF-Mutation im Verbund mit MSS die Prognose ausgesprochen schlecht ist und das 5-Jahres-Gesamtüberleben zwischen 40% und 16,7% beträgt (17). In Studien mit fernmetastasiertem Dickdarmkarzinom (Stadium IV) liegen in der Regel BRAF-mutierte Karzinome mit MSS vor, so dass hier die BRAF-Mutation der Indikator für die schlechteste Prognosegruppe ist (19, 20). Der alleinige Nachweis einer BRAF-Mutation macht daher als prognostischer Biomarker für das sporadische Dickdarmkarzinom keinen Sinn, da eine Abhängigkeit vom MSI-Status bzw. dem MMRD (hMLH1-Ausfall) besteht. Die Kombination aus BRAF-Mutationsstatus (Abb. 3) und MSI-Status stellt hingegen ein klinisch hochrelevantes prognostisches Markerprofil dar, wobei das Markerprofil mit BRAF-Mutation und MSI (bzw. MMRD) mit einer sehr guten, das Markerprofil mit BRAF-Mutation und MSS (bzw. ohne MMRD) mit einer sehr schlechten Prognose assoziiert ist (21).

Abb. 3: Molekularpathologischer Nachweis einer BRAF-Mutation. Pyrogramm der hot-spot-Region des Exon 15 des BRAF-Gens. In A ist die Wildtyp-Sequenz dargestellt. Der neu aufgetretene Peak in Position 14 für Adenosin in B bei gleichzeitiger Verminderung der Peak-Höhe für das nachfolgende Thymidin in Position 15 zeigt eine Mutation c.1799T>A im Exon 15 des BRAF-Gens an.
Abb. 3: Molekularpathologischer Nachweis einer BRAF-Mutation. Pyrogramm der hot-spot-Region des Exon 15 des BRAF-Gens. In A ist die Wildtyp-Sequenz dargestellt. Der neu aufgetretene Peak in Position 14 für Adenosin in B bei gleichzeitiger Verminderung der Peak-Höhe für das nachfolgende Thymidin in Position 15 zeigt eine Mutation c.1799T>A im Exon 15 des BRAF-Gens an.
Abb. 4: Diagnostischer Algorithmus zur morphologischen und molekularen Graduierung von CRC (modifiziert nach (22)). Adenokarzinome NOS werden morphologisch in G1-G3 graduiert. Wenig differenzierte (G3) und undifferenzierte Adenokarzinome sowie morphologische Sondertypen des CRC mit erhöhter MSI-Assoziation (muzinös, siegelringzellig, medullär, serratiert, und cribriform-comedoartig) werden molekular graduiert. Bei Expressionsverlust von hMLH1 oder hMSH2 werden die Tumore als low grade und bei positiver Immunhistochemie als high grade bewertet. Der zusätzliche Nachweis einer BRAF-Mutation bei high grade Karzinomen ist mit einem hoch-agressiven Tumorsubtyp und einer sehr schlechten Prognose assoziiert (modifiziert nach (10)).
Abb. 4: Diagnostischer Algorithmus zur morphologischen und molekularen Graduierung von CRC (modifiziert nach (22)). Adenokarzinome NOS werden morphologisch in G1-G3 graduiert. Wenig differenzierte (G3) und undifferenzierte Adenokarzinome sowie morphologische Sondertypen des CRC mit erhöhter MSI-Assoziation (muzinös, siegelringzellig, medullär, serratiert, und cribriform-comedoartig) werden molekular graduiert. Bei Expressionsverlust von hMLH1 oder hMSH2 werden die Tumore als low grade und bei positiver Immunhistochemie als high grade bewertet. Der zusätzliche Nachweis einer BRAF-Mutation bei high grade Karzinomen ist mit einem hoch-agressiven Tumorsubtyp und einer sehr schlechten Prognose assoziiert (modifiziert nach (10)).

 

Die Bewertung des MSI-Status kann dabei wie bei der molekularen Graduierung anhand einer Immunhistochemie für hMLH1 und hMSH2 erfolgen. Daraus lässt sich für das sporadische CRC ein diagnostischer Algorithmus ableiten (Abb. 4). Wenig differenzierte und undifferenzierte CRC sowie morphologische Sonderformen des CRC werden demnach nach den Vorgaben der WHO molekular graduiert und in Abhängigkeit von ihrem MSI-Status in high und low grade Karzinome unterteilt. Bei den high grade CRC können dann in einem weiteren Schritt durch den Nachweis einer somatischen BRAF-Mutation (Exon 15, V600E) ein besonders aggressiver molekularer Subtyp und die Patienten mit sehr schlechter Prognose identifiziert werden (23).

 

 

Jens Neumann

Dr. med. Dr. med. univ. Jens Neumann

Pathologisches Institut der
Ludwig-Maximilians- Universität München
Thalkirchner Straße 36
80337 München

Tel.: 089/218073634
Fax: 089/218073671
E-Mail: jens.neumann@med.uni- muenchen.de

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ABSTRACT
 



J. Neumann, T. Kirchner, Pathologisches Institut der Ludwig-Maximilians-Universität München

In colorectal cancer (CRC) prognostic markers correlating with distant metastasis are of high clinical value. Within the last years it was demonstrated that sporadic CRC with microsatellite-instability (MSI) exhibit a very low risk for distant spread. Within this group, the medullary subtype represents a morphological prototype. In the new WHO-classification other morphological variants such as mucinous, signet ring cell, serrated, cribriform comedo-type and solid-undifferentiated are graded according to their microsatellite-status. The clinical value of BRAF-mutations is also dependent on the microsatellite-status. Recent data elaborate an ambivalent prognostic impact of BRAF-mutations. A BRAF-mutation in combination with MSI is associated with a good prognosis, whereas a BRAF-mutation against the background of microsatellite-stability (MSS) indicates a very poor outcome.



Keywords: colorectal cancer, CRC, metastasis, microsatellite-instability, MSI, BRAF-mutations, microsatellite-stability, MSS

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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