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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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25. März 2014

Molekulare Diagnostik beim Multiplen Myelom

A. Seckinger, D. Hose, Universitätsklinikum Heidelberg, Medizinische Klinik V.

Die molekulare Diagnostik beim Multiplen Myelom setzt eine Aufreinigung der Myelomzellen aus Knochenmarkaspiraten voraus ("CD138-Aufreinigung"). Sie ermöglicht 1) eine Risikostratifikation und Erfassung therapeutischer Zielstrukturen, 2) die Einteilung in Subgruppen, 3) die Darstellung einer klonalen Heterogenität, sowie 4) eine hochsensitive Aussage über die erreichte Tiefe der Remission. Routine sind die Interphase Fluoreszenz in situ Hybridisierung sowie an wenigen Zentren globale Genexpressionsanalysen mittels DNS-Microarrays. Experimentelle Methoden im Rahmen klinischer Studien umfassen die Array-komparative genomische Hybridisierung, die RNS- sowie die Sequenzierung des Gesamtgenoms. Letztere ermöglicht, alle genetischen Veränderungen in Myelomzellen darzustellen.

Einleitung

Das Multiple Myelom stellt vom klinischen Erscheinungsbild eine relativ einheitliche Entität dar, auf molekularer Ebene handelt es sich jedoch um eine vielschichtige Erkrankung (1). Eine molekulare Charakterisierung ermöglicht hier 1) eine Risikostratifikation und die Erfassung therapeutischer Zielstrukturen, 2) die Einteilung in Subgruppen, 3) die Darstellung einer klonalen Heterogenität, sowie 4) eine hochsensitive Aussage über das Therapieansprechen (Remissionsbeurteilung). Wesentliche Methoden, die routinemäßig zum Einsatz kommen, sind die Interphase Fluo-reszenz in situ Hybridisierung (iFISH) (2-4) sowie, an wenigen spezialisierten Zentren, globale Genexpressionsanalysen (GEP) mittels Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Microarrays (5-9). Durch geeignete Analysemethoden (Genexpressions-Report, GEP-R) kann letztere auch in der klinischen Routine durchgeführt werden (10). Experimentelle Methoden im Rahmen klinischer Studien sind die Array-komparative genomische Hybridisierung (aCGH), die mit einer Auflösung auf dem Niveau unterhalb einzelner Gene Veränderungen in der Kopienzahl (Zugewinne, Verluste) darstellen kann (11, 12); die RNA-Sequenzierung im Sinne einer Transkriptomanalyse ("Super-GEP") sowie die Exon- und Gesamtgenom-Sequenzierung. Letztere ermöglicht es, allegenetischen Veränderungen in Myelomzellen eines Patienten, einschließlich des Auftretens von Punktmutationen, darzustellen (13).

Die Tiefe der durch eine Therapie erzielten Remission steht in engem Zusammenhang mit dem ereignisfreien und Gesamtüberleben. Gleichzeitig stellt das Erreichen einer molekularen kompletten Remission (mCR) die Voraussetzung für eine Heilung des Multiplen Myeloms dar. Diese weitergehende Beurteilung des Therapieansprechens erfolgt innerhalb klinischer Studien wie der GMMG-MM5 Studie in einem abgestuften Vorgehen (Abb. 2, Tab. 1). Im Falle des Erreichens einer CR wird (bei gleichzeitig vorliegendem unauffälligen freien Leichtkettentest im Serum) ein Knochenmarkaspirat mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie untersucht. Bei unauffälligem κ/λ-Leichtkettenverhältnis wird eine stringente komplette Remission (sCR) diagnostiziert, bei fehlendem Nachweis durch ihre Oberflächeneigenschaften charakterisierter maligner Plasmazellen eine durchflusszytometrische molekulare CR (mCRFACS). Im Falle einer mCRFACS erfolgt mittels patientenspezifischer PCR (ASO-PCR) eine noch sensitivere Remissionsbeurteilung. Hierdurch lässt sich eine Myelomzelle in 104-105 (mCRFACS) bzw. 105-106 (mCRPCR) Zellen des Gesamtknochenmarks nachweisen.

Im Folgenden werden zunächst die Methoden, die in die klinische Routine Eingang gefunden haben, beschrieben, gefolgt von solchen, die noch als experimentell angesehen werden. Im Anschluss hieran diskutieren wir deren klinischen, diagnostischen und therapeutischen Stellenwert. Welche Methoden sollen für welche Patienten angewendet werden? Wir schließen diesen Artikel mit einem Ausblick auf die zukünftige Entwicklung der molekularen Diagnostik.

Methoden im klinischen Einsatz


Plasmazell-Aufreinigung

Hintergrund

Da das Knochenmarkaspirat auch bei einem hohen Plasmazell-Infiltrationsgrad ein Gemisch verschiedenster Zellpopulationen darstellt, ist die Gewinnung hochreiner Myelomzellen Voraussetzung für eine molekulare Charakterisierung des Myelomzellklons (Abb. 1).

Methodik

Aus einem Knochenmarkaspirat von 40-80 ml werden mittels Dichtegradientenzentrifugation mononukleäre Zellen isoliert. Anschließend erfolgt eine Positivselektion durch CD138-markierte Microbeads (magnetisch-aktivierte Zellsortierung, MACS) oder fluoreszenzmarkierte CD138-Antikörper (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, FACS). CD138 (Syndecan-1) ist ein für normale wie maligne Plasmazellen charakteristisches Oberflächenantigen (Tab. 2).

Interphase-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (iFISH)

Hintergrund

Die iFISH (Abb. 1) ermöglicht den Nachweis von Veränderungen der Kopienzahl einzelner chromosomaler Regionen, sowie von strukturellen Veränderungen der Chromosomen (Translokationen). Sie ist die am längsten etablierte Methode bezüglich der Risikostratifikation (2-4) und bei über 95% der Patienten umsetzbar.

Methodik

Nach Zentrifugation CD138-aufgereinigter Plasmazellen auf einen Objektträger wird deren doppelsträngige DNS denaturiert und mit fluoreszenzmarkierten, für eine bestimmte chromosomale Region spezifischen DNS-Sonden hybridisiert. Die Anzahl der gemessenen Hybridisierungssignale entspricht dabei der Anzahl an Kopien der jeweiligen Region (zwei Kopien: normaler diploid, drei Kopien: Zugewinn, eine Kopie: Verlust). Die Fusion zweier Regionen, zum Beispiel von 11q13 und 14q32.3 bei einer Translokation t(11;14) (q13;q32.3), kann nachgewiesen werden, indem zwei chromosomale Regionen mit Sonden markiert werden, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. rot und grün; Abb. 1) gekoppelt sind. Im Falle einer Fusion ergibt sich durch Überlagerung der Fluoreszenzen ein andersfarbiges (hier gelbes) Fluoreszenzsignal.

Hierbei werden in einem vollständigen Satz Sonden für die chromosomalen Regionen 1q21, 6q21, 8p21, 9q34, 11q23, 11q13, 13q14.3, 14q32, 15q22, 17p13, 19q13, 22q11, sowie die Translokationen t(4;14)(p16.3;q32.3) und t(11;14)(q13;q32,3) verwendet. Der Mindest-Satz umfasst Sonden für t(4;14), Deletion 17p13 (del17p) und Zugewinn 1q21.

Zur Analyse des Ploidie-Status wird der Score von Wuilleme et al. unter Verwendung der Chromosomen 5, 9, 15, verwendet (20). Für die Untersuchung des Vorhandenseins subklonaler Aberrationen wird eine Myelomzellprobe als eine subklonale Aberration enthaltend gewertet, wenn zumindest eine Aberration in ≥ 60% der Myelomzellen vorhanden ist und zumindest eine andere Aberration in 20-59% der untersuchten Myelomzellen detektiert wird.

- Vorteil: Relativ einfach durchzuführen, Erfassung der klonalen Heterogenität (Subklone)
- Nachteil: Nur eine begrenzte Anzahl an chromosomalen Regionen untersuchbar, interessierende Regionen müssen im Vorhinein definiert werden.
- Status: Routinediagnostik
- Preis: 400-500 € je nach Sondensatz.

Abb. 1: Plasmazellaufreinigung ("CD138-Sortierung") und weiterführende Diagnostik. Die Isolation der Plasmazellen aus Knochenmarkaspiraten erfolgt mittels Dichtegradientenzentrifugation und konsekutiv mittels magnetischer Zellseparation bzw. Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung anhand der Expression des Oberflächenantigens CD138 (Syndecan-1; siehe Tab. 2). Weiterführende Untersuchungen beinhalten Interphase-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (iFISH) und Genexpressionsanalysen (GEP) als Verfahren im Rahmen der Routinediagnostik sowie Array-basierte komparative genomische Hybridisierung (aCGH) und (RNS- bzw. Exon-/Gesamtgenom) Sequenzierung als experimentelle Verfahren. MACS, magnetisch-aktivierte Zellaufreinigung; FACS, Fluoreszenz-aktivierte Zellaufreinigung; RNS, Ribonukleinsäure; DNS, Desoxyribonukleinsäure.

Genexpressionsanalysen (GEP)

Hintergrund

Globale Genexpressionsanalysen (Abb. 1) mit DNS-Microarrays ("Chips") ermöglichen die Erfassung der Expression quasi aller menschlichen Gene (Transkriptom). Im Wesentlichen werden hier nur noch kommerzielle Oligonukleotid-Arrays (wie beispielsweise Affymetrix U133 2.0) verwendet.

Methodik

Aus 20 bis 100 ng der aus aufgereinigten Plasmazellen extrahierten Gesamt-RNS wird in zwei Amplifikationsschritten biotinylierte komplementäre Ribonukleinsäure (cRNS) hergestellt. Die markierte cRNS wird fragmentiert und mit Oligonkleotid-DNS Microarrays hybridisiert. Im Anschluss daran werden die Microarrays gescannt und die relative Fluoreszenzintensität der einzelnen Gene (Probesets) gemessen. Die Fluoreszenz an diesem Ort ist dabei der Menge an gebundener biotinylierter cRNS proportional, die ihrerseits wiederum mit der ursprünglich vorhandenen mRNS-Menge des betrachteten Gens korreliert. Roh-Expressionsdaten (*.cel Dateien) werden auf verschiedene Arten prozessiert und stehen dann zur weiteren statistischen Auswertung zur Verfügung.

- Vorteil: Erfassung der Expression "aller" Gene möglich, keine vorherige Definition interessierender Gene (wie bei PCR); keine Wiederholung zur Erfassung weiterer prognostischer Faktoren bzw. therapeutischer Zielstrukturen notwendig, z.B. falls ein neues Gen bzw. eine neue Zielstruktur interessant wird
- Nachteil: nur wenige Zentren haben hinreichend Erfahrung für den klinischen Einsatz
- Status: (erweiterte) Routinediagnostik.
- Preis: ca. 750 €.
 

Tab. 1: Remissionskriterien. Aufgelistet sind die Remissionskriterien nach der International Myeloma Working Group (IMWG), welche um das minimale Ansprechen (MR, nach EBMT-Kriterien), die nahezu komplette Remission (nCR), die stringente komplette Remission (sCR) sowie die molekulare komplette Remission (mCR) erweitert bzw. modifiziert wurden. mCR, molekulare komplette Remission; PCR, Polymerase-Kettenreaktion; FACS, Durchflusszytometrie; sCR, stringente komplette Remission; FLC, freie Leichtketten; nCR, fast komplette Remission; CR, komplette Remission; VGPR, sehr gute partielle Remission; PR, partielle Remission; MR, minimales Ansprechen; SD, stabile Krankheitsaktivität; PD, Krankheitsprogression.

Genexpressions-Report (GEP-R)

Hintergrund

Wesentliches Element der risikoadaptierten bzw. personalisierten Therapie ist die Erfassung entsprechender Zielstrukturen und Realisierung der Risikostratifikation innerhalb eines Zeitraumes, der es ermöglicht, klinische Konsequenzen umzusetzen (z.B. innerhalb von vier Wochen während des 1. Zyklus der Induktionstherapie).

Methodik

Mit dem GEP-Report (GEP-R) (10) haben wir eine nicht-kommerzielle, adaptierbare Softwareoberfläche entwickelt, welche die molekularen Klassifikationen (14, 15), Risikostratifikation (6, 16, 17) sowie die Erfassung von Zielgenen, z. B. Aurora-Kinase A, fibroblast growth factor receptor 3, insulin like growth factor 1 receptor (7, 18), zur risikoadaptierten bzw. personalisierten Therapie in einen Befund integriert. Zudem wird eine Identitäts- sowie Qualitätskontrolle durchgeführt und der Befund anschließend als pdf-Dokument ausgegeben (Abb. 3A, Tab. 3). In den GEP-Report können zudem neue Zielstrukturen oder Risikofaktoren integriert werden.

Metascoring


Hintergrund

Die Vielzahl prognostischer Faktoren (iFISH, konventionell, GEP-basiert) erschwert es, im klinischen Alltag eine zusammenfassende prognostische Einschätzung zu geben (Tab. 3). Wie ist beispielsweise die Prognose eines Patienten, der Hochrisiko nach UAMS 70 Gen-Score (16) und Niedrigrisiko nach IFM-15-Gen-Score (17) ist, nach unserem genexpressionsbasierten Proliferationsindex (6) ein mittleres Risiko hat sowie ein Stadium I nach dem Internationalen Staging System (ISS) und eine Translokation t(4;14)?

Methodik

Metascoring erlaubt, die relevantesten klinischen (z. B. ISS-Stadium), zytogenetischen und genexpressionsbasierten prognostischen Faktoren in einem Score (z.B. HM-Metascore) zusammenzufassen. Der HM-Metascore ist innerhalb des GEP-Reports implementiert und kann im klinischen Alltag reportiert werden (Abb. 3A) (10). Der Patient aus unserem Beispiel hätte nach dem HM-Metascore ein mittleres Risiko (Abb. 3B).

Experimentelle Methoden


Molekulare Charakterisierung der Myelomzellen

Array-komparative genomische Hybridisierung (aCGH)

Hintergrund

Genomweite Veränderungen der Kopienzahl können mit hoher Auflösung (auf dem Niveau unterhalb einzelner Gene) nachgewiesen werden. Erste Untersuchungen beim Myelom haben prognostische Relevanz gezeigt (11, 12). Es ist jedoch methodenbedingt nicht möglich, 1) balancierte Translokationen (wie die meisten IgH-Translokation; z.B. t(4;14)) zu detektieren und 2) subklonale Aberrationen nachzuweisen.
Methodik

Es finden grundsätzlich zwei Typen von Arrays Verwendung: gespottete, bei der komplementäre DNS-Stücke (cDNS) auf einen Glasobjektträger aufgebracht werden (häufig vom Untersucher selbst hergestellt), und sogenannte Oligonukleotid-Arrays, zum Beispiel Affymetrix-SNP-(single nucleotide polymorphism-) Chips, bei denen in situ auf einem Glasobjektträger spezifische DNS-Sequenzen synthetisiert werden. Bei cDNS-Arrays werden auf einem Objektträger eine Referenz sowie eine Probe, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden (rot, grün), gleichzeitig hybridisiert. Aus Verschiebungen im Hybridisierungsverhältnis resultiert eine Farbverschiebung des Fluoreszenzsignals, aus der sich auf die Kopienzahlen des untersuchten DNS-Abschnittes schließen lässt (Abb. 1).

- Vorteil: Nachweis genomweiter Veränderungen der Kopienzahl
- Nachteil: vgl. 1) und 2)
- Preis: ca. 500-1.000 €.

RNS-Sequenzierung

Hintergrund

Die RNS-Sequenzierung ist eine neue Methode zum Erfassen des Transkriptoms, welche sog. "Deep-sequencing"-Technologien nutzt. Eine RNS-Sequenzierung kann dabei 1) mit geringen RNS-Mengen durchgeführt werden (1 ng RNS vs. 100 ng für Affymetrix DNS-Microarrays). Dies ermöglicht erstmals die umfassende expressionsanalytische Untersuchung früher Myelomstadien mit geringer Tumorlast. Sie ermöglicht ferner 2) eine Quantifizierung von Transkripten ohne signifikante Sättigungseffekte, 3) setzt sie keine a priori Definition von Sequenzen voraus und erlaubt die Erfassung von mutierten Transkripten (z.B. BRAF-Mutationen), 4) erlaubt sie die Analyse von Splicevarianten, und 5) die Untersuchung anderer RNS (z.B. micro-RNS).

Methode

Voraussetzung für die Anwendung von Next Generation Sequenzierungsmethoden (s.u.) ist die Umschreibung der RNS in cDNS. Die bioinformatische Auswertung der Daten ist jedoch im Gegensatz zu GEP (z.B. unter Verwendung des GEP-R) aktuell noch sehr aufwändig, weshalb die RNS-Sequenzierung im Moment nur retrospektiv und meist bei kleinen Kohorten eingesetzt wird.

- Vorteil: vgl. 1) bis 5)
- Nachteil: keine Sättigung (tiefere Sequenzierung notwendig), komplexe Datenauswertung
- Preis: ca. 500-1.000 €.

Sequenzierung: Gesamtgenom- und Exon-Sequenzierung

Hintergrund

Die Gesamtgenom-Sequenzierung (whole genome sequencing, WGS) ermöglicht die Entschlüsselung der kompletten DNS-Sequenz, Exon-Sequenzierung (whole exon sequencing, WES) die Untersuchung der kodierenden Bereiche des Genoms eines Individuums und somit die Identifikation erworbener somatischer Mutationen durch den Vergleich von Myelomzellen mit Normalgewebe des gleichen Patienten. In ersten Untersuchungen bei Patienten mit Multiplem Myelom konnten mit dieser Methode Mutationen in Genen aufgedeckt werden, die bislang in der Myelom-Pathogenese noch unbekannt waren sowie Mutationen in Genen (bspw. BRAF-Gen), gegen die sich entsprechende Inhibitoren bereits in der klinischen Testung befinden (13).

Methode

Next Generation Sequenzierungsmethoden z.B. mittels Illumina HiSeq Technologie basieren auf einer Sequenzierung mittels DNS-Synthese, bei der pro Zyklus eine fluoreszenzmarkierte Base eingefügt und konsekutiv ausgelesen wird.

WGS

- Vorteil: Erfassung der kompletten DNS-Sequenz einschließlich Punktmutationen und struktureller Veränderungen
- Nachteil: sehr große Datenmenge, komplexe und langwierige Datenanalyse
- Preis: ca. 6.000 €.

WES

- Vorteil: zur Untersuchung der klonalen Heterogenität geeignet (tiefe Sequenzierung), im Vergleich zur WGS günstiger, kleinere Datenmenge
- Nachteil: lediglich Erfassung der kodierenden Bereiche des Genoms; kein Nachweis struktureller Aberrationen (z.B. Translokationen), große Datenmenge, aufwändige Datenanalyse
- Preis: ca. 1.000 €.

Tab. 2: Zur phänotypischen Charakterisierung von (malignen) Plasmazellen eingesetzte Antikörper. Aufgelistet sind die im Rahmen der phänotypischen Charakterisierung und MRD-Diagnostik mittels Durchflusszytometrie eingesetzten Antikörper sowie die verwendeten Fluorochrome.
 

Molekulare Untersuchung der Remissionstiefe (MRD-Diagnostik)

MRD-Diagnostik

Voraussetzung für die MRD-Diagnostik ist die Charakterisierung des Phänotyps des malignen Plasmazell-Klons zum Zeitpunkt der Diagnose aus Knochenmarkaspirat im Rahmen der Routinediagnostik mittels Durchflusszytometrie sowie Plasmazell-Aufreinigung und Asservation von RNS/DNS des malignen Myelomzell-Klons.

Für Patienten, die im Verlauf der Therapie eine CR erreichen (Tab. 1), wird die Remissionstiefe mit empfindlichen Methoden in einem stufenweisen Vorgehen weiter untersucht (Abb. 2, Tab. 2). Hierbei wird i) das Vorhandensein einer sCR nach IMWG-Kriterien (19) sowie ii) das Vorliegen einer mCR mittels Durchflusszytometrie (mCRFACS) und ASO-PCR (mCRPCR) bestimmt. Für die MRD-Diagnostik wird a) ein Knochenmarkaspirat (20 ml heparinisiertes Knochenmark) sowie b) 500 µl Serum (freier Leichtkettentest) verwendet. Im Rahmen der Diagnose einer CR sowie der MRD-Bestimmung kommt der folgende Algorithmus zur Anwendung (Abb. 2).

MRD-Bestimmung mittels Durchflusszytometrie (mCRFACS)


Der zum Zeitpunkt der Diagnose ermittelte Phänotyp der malignen Plasmazellen wird für das Monitoring der MRD verwendet. Hierzu wird ein heparinisiertes Knochenmarkaspirat nach NH4Cl-Lyse untersucht. Im Rahmen der GMMG-MM5 Studie finden bspw. die in Tabelle 2 aufgeführten Antikörper Anwendung. Die Durchflusszytometrie unter Verwendung des aufgeführten Antikörpers erlaubt ebenfalls die Ermittlung des κ/λ--Quotienten im Knochenmark zur Bestimmung der sCRgemäß IMWG (19).

- Vorteil: bei fast allen Patienten durchführbar
- Nachteil: geringere Sensitivität als ASO-PCR (10-5)
- Preis: ca. 500-2.000 € (in Abhängigkeit der Anzahl der Bestimmungen).

MRD-Bestimmung mittels ASO-PCR (mCRPCR)

Am häufigsten wird für den Klonalitätsnachweis beim Multiplen Myelom mittels PCR der Immunglobulin-Schwerketten (IgH)-Lokus auf Chromosom 14 verwendet. In diesem sind drei hypervariable complementary-determining regions (CDR) und vier konservierte framework areas lokalisiert. Die CDRs sind aufgrund des Schwerketten-Rearrangements für jeden Antikörper und somit für jeden Myelomzell-Klon charakteristisch. Bei der allele-specific-oligonucleotide-PCR (ASO-PCR) werden Oligonukleotide verwendet, die komplementär zur CDR1 bzw. CDR3-Region des malignen Zellklons sind und den Nachweis einer malignen in 105 bis 106 Zellen des Gesamtknochenmarks erlauben. Bei ca. 90% der Patienten können sequenzspezifische Primer generiert und eine MRD-Diagnostik durchgeführt werden. Diese wird aufgrund des finanziellen Aufwandes im Rahmen der Stufendiagnostik durchgeführt (Abb. 2).

- Vorteil: Detektionslimit > 10-6
- Nachteil: Generierung und Testung Patienten-spezifischer Primer zeit- und arbeitsaufwändig
- Preis: ca. 2.000 € (kaum von der Anzahl der Messungen abhängig).

MRD-Bestimmung mittels Sequenzierung

Eine neue Methode ist die Untersuchung klonaler Rearrangements der Immunglobulin-Gene IgH-VDJ, IgH-DJ bzw. IgK, IgL mittels Next Generation Sequenzierungsmethoden (s. o.).

- Vorteil: keine Patienten-spezifische Generierung von Primern, sehr geringer intrinsischer Hintergrund, Detektionslimit > 10-6 (noch zu validieren)
- Nachteil: gegenwärtig sehr wenigen Zentren vorbehalten
- Preis: ca. 1.000-3.000 € (abhängig von der Anzahl der Messungen).
 

Abb. 2: MRD-Schema. Die tiefergehende Beurteilung des Therapieansprechens (minimale Resterkrankung, MRD) erfolgt im Rahmen der GMMG-MM5 Studie in einem abgestuften Verfahren. Details zu den Remissionskriterien siehe Tab. 1. Antikörper für die Durchflusszytometrie siehe Tab. 2. CR, komplette Remission; KM(P), Knochenmark(punktion); PC, Plasmazellen; mCR, molekulare komplette Remission; sCR, stringente komplette Remission.

Klinischer und therapeutischer Stellenwert

Molekulare Diagnostik - prognostischer und therapeutischer Stellenwert

iFISH

Prognostisch relevant sind hier insbesondere das Vorliegen einer Translokation t(4;14), Deletion des kurzen Arms von Chromosom 17 (del17p), sowie Zugewinne des langen Armes von Chromosom 1 (1q-Zugewinn) (2, 4). Ein alleiniger Verlust des langen Arms von Chromosom 13 (Deletion 13q), lange als wesentlicher prognostischer Faktor angesehen, gilt nicht mehr als solcher (4). In Untersuchungen bei Patienten mit asymptomatischem, nicht-therapiepflichtigem ("smoldering") Myelom konnten wir zeigen, dass Patienten, bei denen eine der bereits beim therapiepflichtigen Myelom mit einer schlechten Prognose assoziierten chromosomalen "Hochrisiko-Aberrationen", (del17p, t(4;14) oder 1q-Zugewinn, s. o.) vorliegt, eine signifikant schnellere Progression zur Therapiepflichtigkeit aufweisen als solche ohne die entsprechende Aberration. Daneben konnten wir Hyperdiploidie als erstes Beispiel für einen adversen prognostischen Faktor beim asymptomatischen Myelom identifizieren, der beim symptomatischen Myelom mit einer guten Prognose einhergeht. Ein Teil der prognostischen Bedeutung von chromosomalen Aberrationen ist somit nicht nur abhängig von der Therapie (entsprechend eines prädiktiven Faktors), sondern eine intrinsische Eigenschaft von Myelomzellen (und damit ein prognostischer Faktor im engeren Sinn). Dies ist insbesondere hinsichtlich von Versuchen relevant, negative prädiktive Faktoren durch eine spezifische Behandlung (z.B. Bortezomib-basierte Therapie, Total Therapy Ansätze) zu überwinden und kann umgekehrt deren Scheitern in einigen Entitäten (z.B. bei Vorliegen einer del17p) erklären.

Eine iFISH-Analyse ist bei geeigneter Logistik und Untersuchungstechnik - auch im Rahmen von Multicenter-Studien - bei über 90% der Patienten möglich und sollte für jeden MyelomPatienten durchgeführt werden. Sie wird von den Krankenkassen übernommen.

GEP

Mittels GEP können die Proliferationsrate der Myelomzellen (genexpressionsbasierter Proliferationsindex, GPI) (6), hochsignifikante GEP-basierte Risikoscores (UAMS 70- und 80-Gen-Score, IFM 15-Gen-Score) (16, 17) sowie einzelne prognostisch und ggf. therapeutisch relevante Gene (z.B. Aurora-Kinase) (7, 18) erfasst werden und damit die beste gegenwärtig verfügbare Risikostratifikation erfolgen (10). Eine Genexpressionsanalyse ist bei geeigneter Logistik und Untersuchungstechnik - auch im Rahmen von Multicenter-Studien wie der GMMG-MM5-Studie bei ≥ 80% der Patienten möglich. Mittels geeigneter Analysemethoden (GEP-R) kann GEP nunmehr auch im Rahmen der klinischen Routine durchgeführt werden. Die GEP wird in den Vereinigten Staaten von einigen Krankenkassen übernommen, in Deutschland Patienten bezüglich Kostenerstattung vorenthalten.

Metascoring

Mittels Metascoring können validierte klinische und genexpressionsbasierte Risikofaktoren in einem Metascore zusammengefasst und die Abgabe einer prognostischen Abschätzung (siehe Beispiel oben) ermöglicht werden. Ein Beispiel ist der sog. HM-Metascore, der aktuell im GEP-R implementiert ist (10).

Eine molekulare Charakterisierung mittels iFISH und (an wenigen Zentren) GEP ist als Standard anzusehen, um die Wirksamkeit der Substanzen in unterschiedlichen molekularen Entitäten bzw. Risikogruppen zu untersuchen. Diese ist innerhalb von einer Woche (iFISH) bzw. vier Wochen (GEP) möglich.

 

 
 




























Abb. 3: Genexpressionsreport (GEP-R). Gezeigt ist (A) der Genexpressionsreport mit Angaben zum Patienten bzw. zum Ausgangsmaterial (linke Seite) sowie den Befunden der Qualitäts- und Identitätskontrolle, häufig beim Multiplen Myelom aberrant oder überexprimierter Gene, den Klassifikationen und Risikoklassifizierungen, Zielgene für immuntherapeutische oder gruppenspezifische Therapien und chromosomale Aberrationen (rechte Seite). (B) Risikostratifikation mittels HM-Metascore. Gezeigt sind das ereignisfreie (EFS) und das Gesamtüberleben (OS) von Patienten, die mittels Hochdosistherapie und autologer Stammzelltransplantation behandelt wurden.

Molekulare Remissionsbestimmung (MRD-Diagnostik)

Hocheffektive Initialtherapien beim Multiplen Myelom werden es ermöglichen, die CR-Rate zu steigern. Für einige dieser Patienten wird es somit möglich sein, im Knochenmark auch mit empfindlichen Methoden keine Tumorzellen mehr nachzuweisen (MRD-Negativität). Eine sehr geringe (<0,01%) oder nicht nachweisbare minimale Resterkrankung (MRD) ist mit einem verlängerten progressionsfreien und Gesamtüberleben assoziiert (20). Eine Erfassung der MRD ist eine Voraussetzung für das therapeutische Vorgehen, z. B. die zeitliche Dauer einer Behandlung mit Medikamenten zur Remissionsverbesserung und -erhaltung, z.B. Immunmodulatoren. Die MRD-Dia-gnostik ist grundsätzlich für jeden Patienten anwendbar, für den initial eine Plasmazellaufreinigung, phänotypische Charakterisierung per Durchflusszytometrie sowie Asservation von DNS bzw. RNS maligner Plasmazellen erfolgte.

Nicht diskutiert wurde hier der erhebliche Stellenwert, den molekulare Diagnostik insbesondere für das Verständnis der Pathogenese des Multiplen Myeloms wie auch die Definition neuer Zielstrukturen hat (5-7, 9, 18).

Schlussfolgerung für die Klinik

Die Möglichkeiten der molekularen Diagnostik machen eine Zusammenarbeit von größeren universitären Zentren mit Kliniken und niedergelassenen Kollegen im Sinne einer optimalen und zeitgemäßen Patientenversorgung mehr als wünschenswert.

Eine iFISH-Analyse sollte bei allen Patienten mit Multiplem Myelom durchgeführt, eine Genexpressionsanalyse angestrebt werden.

Tab. 3: Abgrenzung von Hochrisiko-Patienten mittels verschiedener Variablen und Scores. Gezeigt ist in der ersten Spalte der Prozentsatz an Hochrisiko-Patienten wie mittels des entsprechenden Risikofaktors identifiziert. In den folgenden Spalten ist der Prozentsatz an Patienten angegeben, die zudem durch die entsprechenden anderen Risikofaktoren identifiziert werden. Beispiel: Der GPI identifiziert 7,7% der Patienten als "Hochrisiko", von denen 21,4% ebenfalls durch das Vorhandensein einer Translokation t(4;14) als "Hochrisiko" identifiziert werden.  GPI, Genexpressionsbasierter Proliferationsindex; HR, Hochrisiko; ISS, Internationales Staging System; LDH, Laktatdehydrogenase; t(4;14), Vorhandensein einer Translokation t(4;14); del 17p, Vorhandensein einer Deletion von 17p13.

Künftige Entwicklung

Prognostische Abschätzung

Methodik

Methodisch betrachtet werden in den nächsten Jahren die iFISH-Diagnostik sowie die GEP (bzw. mittelfristig RNS-Sequenzierung) als klinische Routinewerkzeuge eingesetzt werden. Beide Untersuchungen können in der klinischen Routine innerhalb von einer Woche (iFISH) bzw. vier Wochen (GEP) durchgeführt werden. Sie können somit im Rahmen einer klinischen Studie zur Risikostratifikation während des ersten Zyklus einer wirksamen Induktionstherapie eingesetzt werden. Im Falle einer Hochrisikokonstellation könnte dann die Therapie eskaliert werden, z.B. Total Therapy 3 Protokoll (21), im Sinne einer risikoadaptierten Therapie. Wesentlich für ein solches Konzept ist jedoch ein signifikanter Hinweis, dass die entsprechende aggressivere Therapie auch die ungünstige Prognose eines oder einer Kombination von Faktoren aufhebt. Hier muss erneut betont werden, wie wichtig eine entsprechende Untersuchung auf der Basis von GEP und iFISH im Rahmen klinischer Studien wie auch der Routinediagnostik symptomatischer Patienten ist, um entsprechende Informationen zu generieren. Dies gilt insbesondere für die Erfassung prognostischer Faktoren, die von der gewählten Therapie abhängig wie auch unabhängig sind.

Metascoring

Für die klinische Routine ist es zwingend, die Vielzahl klinischer, zytogenetischer und genexpressionsbasierter prognostischer Faktoren in einen Score zusammenzufassen, um für Arzt und Patient eine verständliche Risikostratifikation ("sehr gut", "gut", "schlecht", "sehr schlecht") zu ermöglichen (10). Hier wird es eine der wesentlichen zukünftigen Herausforderungen sein, den prognostisch besten, aber gleichsam auch in der klinischen Routine bestimmbaren Metascore - in Abhängigkeit der applizierten Wirkstoffe - zu entwickeln.

Neue Methoden

Neue Methoden werden bezüglich ihrer prognostischen Bedeutung in prospektiven klinischen Studien getestet, vor allem gilt dies gegenwärtig für die aCGH wie auch, im Laufe der nächsten Jahre, die RNS- bzw. Exon-/Gesamtgenom-Sequenzierung. Dementsprechend wird es wesentlich sein, insbesondere im Rahmen klinischer Studien, eine Asservation primärer Myelomzell-Proben für spätere Untersuchungen in Biobanken durchzuführen.

Therapeutische Konsequenzen

Personalisierte und risikoadaptierte Therapie


Mittels GEP kann die Expression von Zielstrukturen nachgewiesen werden, für die klinisch einsetzbare Inhibitoren geprüft werden. Beispiele stellen mitotische Inhibitoren wie Aurora-Kinase-Inhibitoren (7) dar sowie solche, die spezifische Wachstumsfaktoren und die konsekutive Signaltransduktionskaskade inhibieren, z.B. IGF1R-Inhibitoren (18). Für beide Zielstrukturen ist gleichzeitig eine prognostische Relevanz beschrieben; es handelt sich somit um Zielstrukturen sowohl für eine personalisierte (nur Patienten, die die Zielstruktur exprimieren, werden mit dem entsprechenden Inhibitor behandelt) wie auch risikoadaptierte Behandlung (Patienten, die die entsprechende Zielstruktur exprimieren, haben eine ungünstigere Prognose). Die Expression der gegenwärtig als Zielstrukturen in Betracht kommenden Gene ist im GEP-R integriert (10). Ein mögliches zukünftiges Studienkonzept ist die personalisierte "Add-on"-Therapie zu einer hochwirksamen Induktionstherapie. Denkbar ist, während des ersten Zyklus der Induktionstherapie eine Risikostratifikation mittels iFISH und GEP sowie die Erfassung von Zielstrukturen, z.B. Aurora-Kinase A oder IGF1R, durchzuführen (GEP-R). Im zweiten und dritten Zyklus würde eine zusätzliche Gabe eines Aurora-Kinase A- bzw. IGF1R-Inhibitors bei Expression der entsprechenden Zielstruktur evaluiert werden. Die Studie würde gegen eine hocheffektive Induktionstherapie ohne Inhibitor-Zugabe randomisieren.

Wesentliches gegenwärtiges Hindernis für ein solches Therapiekonzept ist die Verfügbarkeit in klinischen Phase-II-Studien getesteter Wirkstoffe, für die eine eindeutige Zielstruktur definiert ist und die nur bei einem Teil der Patienten exprimiert wird. Da gegenwärtig eine Vielzahl von Wirkstoffen untersucht wird, erscheint ein solches Studienkonzept im Laufe der nächsten 5 bis 10 Jahre als realistisch.

Gesamtgenom-/Exon-Sequenzierung und personalisierte Therapie

Die Erfassung aller chromsomalen Veränderungen einschließlich Punktmutationen (z.B. Aktivierung von Kinasen, gegen die entsprechende Inhibitoren entwickelt sind), ermöglicht den Nachweis einer Vielzahl therapeutischer Zielstrukturen. Die Kosten, gegenwärtig noch um 6.000 € pro Genom, werden, schreibt man die Preisentwicklung der Sequenzierungskosten fort, in den nächsten zwei Jahren unter 1.000 € fallen und damit in der Größenordnung der iFISH, GEP und aCGH liegen. Wesentlich wird hier sein, eine geeignete bioinformatische Auswertestrategie (analog GEP-R) zu entwickeln, die einen klinischen Routineeinsatz ermöglicht. Da keine Aberration bei allen Patienten zu finden ist und die häufigsten bisher gefundenen Aberrationen in 23% (KRAS) der Patienten auftreten und bei einzelnen eine Vielzahl von Aberrationen vorliegen (13), ist noch in viel stärkerem Maße von "Many and Multiple Myelomas" (1) auszugehen. Aufgrund der Seltenheit des Auftretens zahlreicher Zielstrukturen (z.B. TP53 in 8% der Myelompatienten) (13), wird es notwendig sein, Zielstrukturen entitätsübergreifend zu betrachten. Eine entsprechende Diversifizierung der Therapie auf der Basis eines dem oben aufgeführten Studienkonzept einer personalisierten "Add-on-Therapie"-analogen Konzepts wird, aufgrund der Vielzahl der in klinischen Studien zu testenden Wirkstoffe, dem nächsten Jahrzehnt vorbehalten sein.

Aus pathophysiologischer Sicht ist die Frage, ob unter verschiedenen Therapien eine lineare Entwicklung eines Myelomzellklones vorliegt, oder klonale Tiden unterschiedlicher Myelomzellklone. Erste experimentelle Daten zeigen eine klonale Heterogenität zum Zeitpunkt der Diagnose wie auch das Auftreten unterschiedlicher klonaler Tiden zum Zeitpunkt der Krankheitsprogressionen nach erfolgreicher Therapie, letztere aufgrund des chemotherapeutischen Selektionsdruckes (22-24). Angesichts des häufigen Vorhandenseins multipler (diskreter) fokaler Läsionen bzw. diffuser Verteilung über das Knochenmark, die nicht in der Knochenmarkaspiration der Spina iliaca posterior superior erfasst sind, könnte zusätzlich zur temporalen eine spatiale klonale Heterogenität vorliegen (22). Auf Basis dieser Daten könnten zukünftig wichtige klinische Konsequenzen gezogen werden (23): i) Sequenzielle Therapien mit Einzelsubstanzen sollten vermieden und stattdessen (möglichst) alle koexistierenden Subklone mit Kombinationstherapien, z.B. Total Therapy 3 Protokoll (21), eradiziert werden. Eine frühe suboptimale Behandlung könnte dagegen präferentiell einen eher indolenten Klon eradizieren und damit "Platz" für einen aggressiveren Subklon schaffen. ii) Speziell in einem späteren Rezidiv kann, in Abhängigkeit der Verfügbarkeit alternativer Therapielinien, eine Re-Exposition mit einer Therapielinie versucht werden, unter der ein Krankheitsprogress auftrat, wenn zwischenzeitlich unter einer anderen Therapie möglicherweise wieder ein sensitiver Subklon aufgetreten ist. iii) Ein teilweises Ansprechen (z.B. partielle Remission) muss nicht die partielle Suppression der gesamten Tumorzell-Population, sondern kann ebenso lediglich die eines sensitiven Klons bedeuten, während ein refraktärer Klon stabil bleibt und proportional dominanter wird.

Lokale Behandlung fokaler Läsionen als Quelle des Rezidivs bei MRD-Negativität

Residuale Myelomzellen vor allem in osteolytischen bzw. fokalen Läsionen als Überlebensraum für Myelomzellen nach erfolgreicher Therapie i) bei Patienten, die im sonstigen Knochenmark eine MRD-Negativität zeigen, ii) als Ursache der Progredienz von osteolytischen Läsionen und konsekutiv notwendiger erneuter chemotherapeutischer Behandlung sind putativ ursächlich dafür, dass fast alle Patienten einen Krankheitsprogress bzw. ein Rezidiv erleiden und das Myelom eine i.d.R. unheilbare Erkrankung ist. Eine lokale Kontrolle dieser residuellen Myelomzellpopulation könnte das Zeitintervall bis zu einer erneut notwendigen Chemotherapie verlängern bzw. zu einer Heilung des Myeloms in einer Subgruppe von Patienten beitragen. Eine Eradikation entsprechender fokaler Herde mittels Bestrahlung oder lokaler Therapie durch Wirkstoff-freisetzende Knochenersatzstoffe, wie sie z.B. im SFB/Transregio TRR79 (http://www.uni-giessen.de/cms/fbz/fb11/forschung/schwerpunkte/sfb/trr79) entwickelt und untersucht werden, könnte ein myelomfreies Überleben und damit eine Heilung zumindest bei einem Teil der Patienten herbeiführen.
 

 

 

Dr. med. Anja Seckinger

Universitätsklinikum Heidelberg
Medizinische Klinik V
Im Neuenheimer Feld 410
69120 Heidelberg

E-Mail: Anja.Seckinger@med.uni-heidelberg.de
 



 

Dr. med. Dipl.-Phys. Dirk Hose

Universitätsklinikum Heidelberg
Medizinische Klinik V
Im Neuenheimer Feld 410
69120 Heidelberg

E-Mail: Dirk.Hose@med.uni-heidelberg.de



Abstract


A. Seckinger, D. Hose

Molecular diagnostics in multiple myeloma prerequisites the purification of myeloma cells from bone marrow aspirates ("CD138-purification"). It allows 1) risk stratification and assessment of therapeutic targets, 2) classification of subgroups, 3) investigation of clonal heterogeneity, and 4) highly sensitive assessment of the achieved depth of remission. Methods routinely used comprise interphase fluorescence-in-situ-hybridization and, at certain institutions, gene expression profiling using DNA-microarrays. Experimental methods within clinical trials are array-comparative genomic hybridization, RNA- as well as whole genome sequencing approaches; the latter enabling to depict all genetic changes in myeloma cells.

Keywords: Molecular diagnostics, iFISH, GEP, next generation sequencing
 


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