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JOURNAL ONKOLOGIE – Artikel
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05. März 2013

CML: Optimierte molekulare und zytogenetische Diagnostik

M. C. Müller1, C. Dietz1, A. Fabarius1, T. Ernst2, B. Hanfstein1, T. Lange3, A. Hochhaus2, 1III. Medizinische Klinik - Hämatologie und Onkologie, Universitätsme

Die Molekulargenetik hat sich neben der mikroskopischen Zytologie (Differentialblutbild) und Zytogenetik (Chromosomenanalyse) als sensitivste Technik in der Diagnostik und Verlaufskontrolle der chronischen myeloischen Leukämie (CML) etabliert. So lässt sich die Diagnose CML mittels PCR aus peripherem Blut durch den Nachweis des BCR-ABL-Fusionstranskripts stellen, dem auf chromosomaler Ebene die Translokation t(9;22)(q34;q11) entspricht. Molekulares Therapiemonitoring durch standardisierte quantitative Bestimmung von BCR-ABL und molekulare Resistenzdiagnostik bei Therapieversagen mittels Mutationsanalysen sind unter gezielter molekularer Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) zu unverzichtbaren Instrumenten der individuellen Therapiesteuerung geworden. Die Zytogenetik hat durch Detektion von zusätzlichen chromosomalen Veränderungen zum Diagnosezeitpunkt sowie im Falle einer Progression einen weiteren prognostischen Einfluss auf den Krankheitsverlauf.

Zytogenetik

Die charakteristische zytogenetische Aberration der Leukämiezellen resultiert aus einer reziproken balancierten Translokation zwischen den Telomerregionen der langen Arme von Chromosom 9 und Chromosom 22 mit den Bruchpunkten in q34 und q11, t(9;22)(q34;q11), durch die das sogenannte Philadelphia-Chromosom (Ph) entsteht, das dem verkürzten Chromosom 22 entspricht (Abb. 1) (1). Bei mehr als 90% aller an CML erkrankten Patienten treten dabei die typische Standardtranslokation t(9;22)(q34;q11) oder eine variante Translokation t(v;22) auf. Bei der varianten Translokation, die 5-10% der CML-Patienten aufweisen, sind die Chromosomen 9 und 22 sowie ein oder mehrere zusätzliche Chromosomen beteiligt (Abb. 2). In ca. 5% der Patienten ist die Translokation auf zytogenetischer Ebene nicht nachweisbar, obwohl das BCR-ABL-Fusionsgen vorliegt. Hier kommt die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) methodisch zum Einsatz. Die FISH weist die Translokation durch den Einsatz zweier genspezifischer Sonden (z.B. grün und rot) nach. Bei Zellen, die die Translokation tragen, wird durch die Bildung des BCR-ABL-Fusionsgens die Detektion eines Kolokalisationssignals (grün + rot = gelb) möglich. Aufgrund verfügbarer sensitiver molekulargenetischer Methoden spielt die FISH in der CML-Diagnostik aber eine untergeordnete Rolle. Die durch die konstitutionell aktivierte BCR-ABL-Tyrosinkinase verursachte genetische Instabilität kann zur Akkumulation zusätzlicher chromosomaler Aberrationen (engl. additional chromosomal aberration, ACA) und weiterer Mutationen führen, die eine Progression hin zur akzelerierten Phase (AP) oder Blastenkrise (BK) begünstigen (2). Über 80% der CML-Patienten, die sich in der BK befinden, weisen zusätzliche Aberrationen auf (3). Solche zusätzlichen numerischen und/oder strukturellen Aberrationen wie Trisomie 8, Trisomie 19 (Abb. 3), ein zusätzliches Ph oder ein Isochromosom für den langen Arm von Chromosom 17, (i(17)(q10); major route ACA), sind häufig bei Krankheitsprogression zu beobachten, wohingegen reziproke Translokationen, bei denen andere zusätzliche Chromosomen involviert sind, eher selten zu finden sind (z.B. t(3;12), t(1;21), t(4;6) etc.; minor route ACA). Ungefähr 10-12% der CML-Patienten in der chronischen Phase (CP) weisen bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung zusätzliche chromosomale Veränderungen auf, die je nach ihrer Art einen Einfluss auf die Prognose des Krankheitsverlaufs haben. Major route ACAs korrelieren dabei im Vergleich zu minor route ACAs mit einer schlechteren Prognose und erfordern eine sorgfältigere Überwachung sowie eine eventuell intensivere Therapie (4).
 

Abb. 1: Karyotyp eines CML-Patienten mit der Standardtranslokation t(9;22)(q34;q11).
 

Molekulargenetik

Mit der Einführung und Entwicklung von Methoden zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung der BCR-ABL-Transkripte durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde Ende der 90er Jahre der Grundstein für die erste klinisch angewandte molekulargenetische Methodik in der Hämatologie gelegt. Waren anfänglich mittels einstufiger PCR oder zweistufiger nested-PCR nur das Vorliegen oder die Abwesenheit der Fusionstranskripte bestimmbar, so sind heute mit Hilfe der real-time quantitativen PCR (RQ-PCR) die genaue Anzahl der BCR-ABL-Transkripte sowie des Kontrollgens quantitativ detektierbar (5-7). Die Expression von BCR-ABL bzw. des Kontrollgens wird dabei mit fluoreszenzmarkierten Hybridisierungs- oder Hydrolysesonden gegen einen Plasmidstandard bekannter Konzentration gemessen und anschließend die ermittelte Transkriptanzahl im Verhältnis von BCR-ABL zu Kontrollgen auf einer logarithmischen Skala dargestellt (8).
 

 Abb. 2: Karyotyp eines CML-Patienten mit einer varianten Translokation t(1;9;22)(q32;q34;q11).
 

Mittlerweile spielt die Beurteilung der quantitativen BCR-ABL-Expression aus dem peripheren Blut eine immer wichtigere Rolle bei der frühzeitigen Beurteilung der Prognose unter Therapie mit TKI. Bereits nach 3 Monaten zeigt das Unterschreiten einer BCR-ABL-Expression unter 10% nach Standardisierung gemäß International Scale (BCR-ABLIS) einen signifikanten Vorteil für progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben im Vergleich zu denjenigen Patienten an, deren Ansprechen schlechter ist. Das molekulare Ansprechen nach 6 und 12 Monaten (1% BCR-ABLIS) hat ebenso einen deutlichen prognostischen Einfluss (9, 10). Des Weiteren können steigende BCR-ABL-Expressionswerte im Verlauf der Erkrankung eine drohende Resistenzentwicklung oder eine unbefriedigende Therapietreue des Patienten frühzeitig erkennen, bevor die Erkrankung mit konventioneller Zytogenetik, im Blutbild oder durch klinische Symptomatik wieder nachweisbar wird.
 

Abb. 3: Karyotyp eines CML-Patienten mit einer Standardtranslokation t(9;22)(q34;q11). Zusätzliche numerische Veränderungen wie Trisomie 8 und Trisomie 19 können Zeichen für eine Progression der Erkrankung oder Transformation zur Blastenkrise sein.
 

Um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen unterschiedlichen Laboren zu ermöglichen, wurde im Rahmen einer internationalen Konferenz im Jahre 2005 beschlossen, laborspezifische Konversionsfaktoren zu bestimmen, mit welchen die lokalen Ergebnisse multipliziert werden und damit auf einer international vergleichbaren Skala (Internationale Skala, IS) berichtet werden können (11). Die Konversionsfaktoren können durch Probenaustausch zwischen Referenzlaboren mit teilnehmenden Laboren im Falle guter Übereinstimmung der Ergebnisse bestimmt werden. Hierbei sollte beachtet werden, dass die sog. Internationale Skala, an welcher sich die Standardisierung orientiert, eine absolute Skala darstellt, welche ihren Ursprung im Monitoring der IRIS-Studie hat (International Randomized Study of Interferon and STI571) (12). Im Jahre 2000 wurden zur Bestimmung der Baseline der Internationalen Skala 30 Proben von erstdiagnostizierten CML-Patienten an die damals drei teilnehmenden Labore verschickt. Die jeweils lokal gemessene mediane BCR-ABL-Expression wurde auf 100% normalisiert und stellt seitdem den orientierenden Anker dar. Somit sind quantitative BCR-ABL-Ergebnisse, welche anhand der Internationalen Skala ausgedrückt werden, nicht relativ zum Ausgangswert des einzelnen Patienten zu werten (13). Die Harmonisierung der BCR-ABL-Methodik wird in vielen Regionen der Welt vorangetrieben, besonders intensiv sind die diesbezüglichen Bemühungen in Europa, wo seit 2007 im Rahmen der EUTOS for CML (European Treatment and Outcome Study) über 60 europäische Labore in 28 Ländern in regelmäßigem Probenaustausch mit dem Europäischen BCR-ABL-Referenzlabor in Mannheim lokale Konversionsfaktoren validieren und revalidieren (14). Im Rahmen der europaweiten Harmonisierung stellt in den letzten Jahren die Erhöhung der Sensitivität der jeweiligen Methodik eine große Herausforderung dar. Eine hinreichend sensitive Messung bis in den Bereich einer tiefen molekularen Remission, d.h. einer Reduktion der BCR-ABL-Transkripte um bis zu 4,5 bis 5 Log-Stufen, ist noch nicht in allen Laboren verwirklicht. Diese Empfindlichkeit ist notwendig, um Patienten zu bestimmen, welche aufgrund einer andauernden tiefen Remission für einen engmaschig überwachten Absetzversuch der TKI-Therapie im Rahmen von Studien geeignet sind (15). Hierzu bieten sich auf folgenden methodischen Ebenen Optimierungsmöglichkeiten:

Vom peripheren Blut über RNA zur cDNA

Für die Bestimmung der BCR-ABL-Transkripte in der CP der CML sollten 10 ml peripheres Blut verwendet werden. Zur Beurteilung sollte peripheres Blut der Verwendung von Knochenmark vorgezogen werden, da die Zellzahl wesentlich besser bestimmbar ist (16). Eine zusätzliche Aufreinigung mittels Ficoll wird auf Grund der geringeren Sensitivität der angereicherten Leukozyten im Vergleich zur Verarbeitung der gesamten Leukozyten nach Erythrozytenlyse nicht empfohlen. Auf eine Mindestzahl von 10-20 Millionen Leukozyten pro Aufarbeitung ist zu achten. Das präferierte Antikoagulans ist EDTA, Heparin sollte wegen eines möglichen hemmenden Einflusses auf die PCR vermieden werden. Die Proben sollten für eine sensitive Messung der minimalen Resterkrankung (MRD) innerhalb von 24 bis 36 Stunden prozessiert werden, um eine Degradierung der RNA zu vermeiden. Die RNA-Extraktionsmethode mit der größten Ausbeute stellt seit vielen Jahren die Trizol-Methode dar, wobei im Vergleich zu kommerziellen Kits eine bis zu 5-fach höhere RNA-Ausbeute erzielt werden kann. Der Nachteil dieser Methode liegt in der aufwändigeren Bearbeitung und in der Verwendung von Phenol und Chloroform, wofür ein Arbeitsplatz mit Luftabzug erforderlich ist. Für die reverse Transkription der RNA in cDNA wird der Einsatz von Random-Primern empfohlen, wobei eine finale Konzentration von mindestens 25 µM die Sensitivität erhöht (17). Die Wahl der Reversen Transkriptase kann dabei einen großen Einfluss auf die Ausbeute und Effizienz haben und sollte individuell getestet und optimiert werden. Am häufigsten verwendet werden die Reversen Transkriptasen Superscript (Life Technologies) und MMLV (aus Moloney-Mäuseleukämievirus, Life Technologies).

RQ-PCR und die Wahl des Kontroll-Gens

Für die Etablierung einer RQ-PCR zur Detektion von BCR-ABL-Transkripten eignen sich Technologien, in denen Hydrolyse- oder Hybridisierungssonden verwendet werden. Beide Methoden haben gezeigt, dass sie vergleichbare Ergebnisse liefern können (18, 19). Neben kommerziell erhältlichen Kits orientieren sich die meisten deutschen Labore an Empfehlungen der EAC-Initiative (Europe Against Cancer) für TaqMan-Plattformen sowie an lokal etablierten und vielfach übernommenen PCR-Bedingungen für LightCycler-Plattformen (8, 14, 17, 19). Alternative Plattformen für Niedrig-Durchsatz-Labore auf Basis von geschlossenen Cartridge-Systemen befinden sich in Testung (20). Als Kontrollgene fungieren ABL, BCR und β-Glucuronidase (GUS), wobei ABL das geeignetste und am häufigsten verwendete Kontrollgen darstellt (21). Zur Quantifizierung verschiedener Tiefen des molekularen Ansprechens werden pro PCR-Reaktion folgende Mindestwerte von ABL-Transkripten gefordert (22):

- 10.000 für eine MR4 (≤ 0,01% BCR-ABLIS)
- 32.000 für eine MR4,5 (≤ 0,0032% BCR-ABLIS)
- 100.000 für eine MR5 (≤ 0,001% BCR-ABLIS)

Durch Optimierung der eingesetzten Zellzahl, der RNA-Extraktionsmethode, der in die cDNA-Synthese eingesetzten RNA-Menge, der Wahl der Reversen Transkriptase sowie des PCR-Protokolls lässt sich in vielen Fällen die Gesamt-Empfindlichkeit der Methode verbessern, was an einer hohen Anzahl an ABL-Transkripten der jeweiligen Probe ablesbar ist. Das Erreichen eines negativen BCR-ABL-PCR-Ergebnisses ist bedeutungslos, solange die Probe keinen ausreichend hohen ABL-Wert erzielt. Um falsch negative Ergebnisse infolge schlechter Probenqualität zukünftig zu vermeiden, sollte in jedem molekulargenetischen Befund die Sensitivität in Form der ABL-Transkripte zusätzlich angegeben werden.

Fazit


Der Stellenwert der zytogenetischen Chromosomen-Analyse aus Knochenmark hat kürzlich durch Beschreibung von prognostisch ungünstigen Zusatzaberrationen zum Erstdiagnosezeitpunkt zugenommen. Des Weiteren konnte die prognostische Relevanz des frühen molekularen und zytogenetischen Ansprechens herausgearbeitet werden. Die Vorzüge des molekularen Monitorings aus peripherem Blut liegen in der hohen Sensitivität der Methode, welche einem kontinuierlichen Verbesserungsprozess unterzogen werden sollte, um den Anforderungen der Detektion von sehr tiefem molekularen Ansprechen gerecht werden zu können. Dies wird unter anderem als Einschlusskriterium für die Teilnahme an Therapie-Unterbrechungsstudien immer bedeutender. International vergleichbare BCR-ABL-Expressionswerte können in Zukunft nur gewährleistet werden, wenn Labore sich weiterhin einer regelmäßigen Qualitätskontrolle in Form von Ringversuchen mit Referenzlaboren unterziehen.


Prof. Dr. med. Martin C. Müller

III. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin Mannheim
Pettenkoferstr. 22
68169 Mannheim

Tel.: 0621/383 6945
E-Mail: martin.mueller@umm.de


Abstract

M. C. Müller1, C. Dietz1, A. Fabarius1, T. Ernst2, B. Hanfstein1, T. Lange3, A. Hochhaus2, 1III. Medizinische Klinik - Hämatologie und Onkologie, Universitätsmedizin Mannheim, 2Abteilung für Hämatologie und Internistische Onkologie, Klinik für Innere Medizin II, Universitätsklinikum Jena, 3Hämatologie, Onkologie, Hämostaseologie, Universitätsklinikum Leipzig

Standardized molecular monitoring of BCR-ABL mRNA transcripts has been established as the most sensitive technique of diagnosis and follow-up in chronic myeloid leukemia (CML) patients. Its prognostic impact on outcome has been demonstrated by independent groups using several tyrosine kinase inhibitors. Nevertheless, laborious harmonization efforts are necessary in order to guarantee comparability of molecular results between different laboratories. Chromosome banding analysis has confirmed its role in prognosticating outcome at early timepoints on treatment and at the time of diagnosis by detecting critical additional chromosomal aberrations.

Keywords: CML, BCR-ABL, molecular monitoring, RQ-PCR, cytogenetics, ACA


Literaturhinweise:
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